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P16基因沉默及对人毛乳头细胞的影响

作　者: 赵璐
导　师: 高顺强
学　校: 河北医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 毛乳头细胞凝集性生长 RNAi P16基因 PCR 免疫荧光流式细胞技术电镜
分类号: R751
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：基因沉默（Gene Silencing)是真核生物细胞基因表达调节的一种手段。基因沉默有多种方法，RNA干扰（RNAinterference, RNAi）现象是一种转录后的基因沉默，即由内源性或外源性同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的目的mRNA高效特异性降解的现象。人毛乳头细胞（dermal papilla cells，DPCs）是一簇间充质细胞位于毛囊基底部，也是一种特化的成纤维细胞，其对毛囊的诱导和分化有重要作用。研究表明毛乳头细胞这种作用与其在体内外成特征性凝集性生长有密切的关系，体外实验证明，毛乳头细胞会随着传代次数的增加而逐渐失去其凝集性生长的特性，细胞传代至7、8、9代时这种特征性的凝集性生长基本消失，随着此特性消失，毛乳头细胞对毛囊形态学的影响及生长周期的调控作用也逐渐消失，从而导致了斑秃等毛发疾病的发生。P16基因为细胞周期调控因子，其主要通过抑制细胞周期蛋白激酶4（cyclindependent kinase,CDK4）而发挥作用，主要功能使细胞周期从G1期进入S期受阻，从而对细胞周期进行调控。有研究发现，高传代的毛乳头细胞中P16蛋白的表达量较低传代的毛乳头细胞中高，P16基因可能与细胞衰老有关。毛乳头细胞高传代时失去其特征性的凝集性生长，细胞周期延长，P16蛋白表达量增加，考虑将将P16基因沉默后，毛乳头细胞能否延迟衰老，或恢复其特征性凝集性生长，从而恢复对毛囊的调控作用，为毛发疾病，特别是斑秃的治疗提供新的方法？方法：1实验分组将购得的人毛乳头细胞随机分为三组，分别为基因沉默组、阴性对照组和正常组。2人毛乳头细胞的RNA干扰。将复苏后的毛乳头细胞培养于专用MSCM培养基中，并置于37℃、适宜湿度、5%的CO2培养箱内常规传代培养。待细胞融合率达60％-70％后，根据预实验，于基因沉默组和阴性对照组细胞中分别加入含有适量的病毒颗粒的无血清培养基，4小时后，更换为MSCM培养基，待温箱内放置48小时后，于荧光显微镜下观察人毛乳头细胞的细胞转染率。3倒置相差显微及电镜下观察，不同组细胞的细胞形态及生长状态的不同。4MTT法测不同组细胞的生长曲线。5PCR方法检测不同组细胞P16基因mRNA的表达量，内参照为甘油醛-3磷酸脱氢酶（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）。6用免疫荧光法及流式细胞仪检测不同组细胞的P16蛋白的表达异。7流式细胞仪测定基因沉默后不同组细胞的细胞周期及凋亡。8运用统计软件SPSS13.0对所得数据进行统计和处理。结果：1细胞转染效率大约为70%-80%，符合实验要求（Fig.2-2）。2倒置相差显微镜及电镜下观察，P16基因沉默组及阴性对照组较正常组有较多的核分裂，及细胞表面的颗粒样物质（Fig.2-3、Fig.2-4）。3MTT法测定不同时间不同组细胞吸光度值改变，从而绘制出各组细胞的生长曲线，结果（Fig.2-5、Table2-3）正常组第1-5天的吸光度分别为0.196±0.030、0.266±0.048、0、325±0.027、0.369±0.045、0.465±0.057；阴性对照组为0.164±0.039、0.283±0.063、0.314±0.064、0.406±0.075、0.437±0.070；基因沉默组为0.206±0.047、0.253±0.033、0.359±0.081、0.519±0.079、0.536±0.052。4普通PCR结果显示内参照组的亮度基本相同，实验组基因沉默组的亮度明显暗于阴性对照组和基因沉默组（Fig.2-7），Q-PCR结果显示表示P16基因mRNA的含量的RQ值基因沉默组为0.04±0.007；阴性对照组为0.66±0.356；正常组为1（Fig.2-8、Table2-2）。5免疫荧光法测定不同组细胞P16蛋白表达量结果显示基因沉默组荧光量最弱，阴性对照组荧光量与正常组荧光量比基因沉默组强（Fig.2-10）。6流式细胞仪测定3组细胞P16蛋白表达量结果为，所得到的FI值基因沉默组4代细胞为2.43±0.02,8代细胞为2.04±0.06；阴性对照组4代细胞为2.25±0.03,8代细胞为1.91±0.07；基因沉默组4代细胞为1.27±0.31,8代细胞为1.2±0.05（Fig.2-10、Table2-4）。7流式细胞仪测定3组细胞的细胞周期及凋亡率，测定细胞凋亡率结果为基因沉默组为8.92±0.61，阴性对照组为4.35±0.05，正常组为2.86±0.07；测定细胞周期时G1%基因沉默组为57.8±4.38，阴性对照组为68±1.27，正常组为82.1±0.99；S%含量基因沉默组为45.1±1.27；阴性对照组为26.7±0.71，正常组为8.6±4.45（Fig.2-11、Table2-5）。结论：1P16基因可能通过细胞周期的调节，抑制细胞的生长。2P16基因可能与细胞的衰老有关。3可以通过调节人毛乳头细胞P16基因的表达量，为斑秃的患者提供一种新的治疗方法。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11-12
材料和方法  12-22
结果  22-25
附图  25-30
附表  30-34
讨论  34-37
结论  37
参考文献  37-40
综述基因沉默的研究进展及其应用  40-50
  参考文献  46-50
致谢  50-51
个人简历  51

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