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一种新型细胞压力加载系统的研制及压力对BMSCs生物学特性与软骨向分化影响的研究

作　者: 刘岩正
导　师: 张旻
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 压力骨髓间充质干细胞力学生物学增殖软骨向分化
分类号: R783.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

颞颌关节（temporomandibualr joint,TMJ）作为人体内最复杂、精细的关节之一，具有运动灵活的特点以及负重的功能。它生长与改建的动力来自于下颌运动时其所承受的负荷，髁突软骨既是TMJ的应力敏感与受力改建的重要区域，也是关节运动过程中不可或缺的重要组成部分。它虽然仅数毫米厚，却具有非常高的抗压硬度和弹性，并且能在关节运动过程中分散压力。临床上，由于炎症、肿瘤、外伤和发育异常等多种原因造成的关节软骨缺损或变性坏死很常见。但由于关节软骨缺乏血液供应、细胞代谢缓慢，加之关节软骨一般都需要持续在正常范围内的力学刺激以维持其结构和功能的完整性，而TMJ在各个方向的运动过程中关节内都承受着一定的压力，而且压力性质从正压到负压比较复杂，压力水平变动范围也随着下颌不同的运动方式与幅度而变化较大，因此对髁突软骨而言，其所承受的复杂力学微环境成为TMJ软骨改建与再生的重要物理条件。在诸多的具有成软骨潜能的干细胞中，骨髓间充质干细胞（Bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs）以来源广泛的特点优于骨膜源性干细胞、以更高成软骨潜能的特点优于脂肪干细胞、以纯化相对简便且不存在伦理学问题的特点优于胚胎干细胞。因而，将BMSCs作为种子细胞与支架材料复合后移植到软骨缺损部位或采用内源性再生的方法诱导内源性BMSCs归巢而促进髁突软骨改建与再生，被认为是现今最好的修复软骨缺损的方法之一。但是其最大的缺陷在于所生成的软骨细胞外基质力学性能不足。有研究表明力学刺激本身就可以诱导部分BMSCs向软骨细胞分化，并形成基质成分更为丰富的软骨组织。有学者提出，标准的BMSCs体外成软骨分化过程必须加入力学刺激以抑制所形成软骨的过度增生肥大，从而保证所生成软骨组织的力学特性。因此要成功产生关节软骨，还需对BMSCs的生长微环境进行合理的体外模拟和体内控制。由于下颌在运动时，其关节内压力可以从张口时较大的负压一直变化到闭口时较小的正压乃至紧咬时较大的正压，力值范围变动之大、力学性质之复杂使得其髁突软骨的改建与再生修复后的转归难以控制。到目前为止，还没有细胞力学装置能够完成如此复杂力学微环境的模拟，因此在复杂而特殊的TMJ力学微环境中髁突软骨再生修复的生物力学调控效应与机理至今不明。针对上述问题，本研究拟在本课题组前期自行研制的可控液压细胞加载装置的基础上，突破正-负压力转换、温度控制等多个技术难关开发一种多功能动静态体外细胞正-负压加载系统，以实现在同一个细胞力学装置上对静态负压、动态负压、静态正压、动态正压以及动态正-负压等多种压力作用方式的体外模拟；进一步通过对不同压力条件作用下BMSCs从增殖活性、细胞周期到超微结构、细胞骨架、凋亡情况、乃至BMSCs的成软骨向分化能力等多方面的检测，揭示仿TMJ不同功能状况的压力微环境对基于BMSCs的关节软骨再生的力学生物学效应，以期为今后关节软骨组织工程修复的生物力学调控提供理论依据与研究基础。课题主要分为以下两大部分展开。第一部分一种新型多功能体外细胞动静态正-负压加载系统的研制该系统由细胞培养系统、驱动控制系统、数据采集处理系统三部分组成，通过压力控制系统对细胞培养箱内加载静态或周期性变化的正压、负压或正-负压，并作用于培养皿中的细胞，从而实现不同压力作用条件对细胞影响的研究。参数设置为：压力调节范围-50~300KPa，动压调节控制精度±5%，静态负压调节控制精度±1%，静态正压调节控制精度±3%，温度36±2℃，加载的频率为0.01Hz—0.1Hz。该装置采用恒温水槽与辅助加热装置联合应用的方式克服不同性质与范围压力变化时的温度补偿，以维持细胞培养箱内的恒温；采用压缩泵和真空泵联合使用的压力驱动系统，以提供较大范围的正压和负压调节；采用计算机软件监控下的控制面板，实时监控培养箱的压力变化轨迹、压力波形曲线及温度。同时，该装置具有操作简单、压力控制精度较高、温度控制稳定、压力作用模式种类多、压力作用范围宽、性能可靠等特点，除了本研究所涉及的BMSCs外，还适合对关节软骨细胞、成骨细胞、牙周膜细胞等多种压力相关细胞进行体外细胞力学研究。第二部分压力作用下骨髓间充质干细胞的力学生物学响应本部分的实验一，首先采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，并通过绘制细胞生长曲线，表面标志物和多向分化能力鉴定，鉴定证明所培养细胞确为间充质来源的干细胞。本部分的实验二，应用第一部分中自行研制开发的新型细胞体外压力加载系统，采用五种不同性质的压力对体外培养的BMSCs进行细胞力学加载，包括：静态负压（10KPa、-20KPa、-30KPa、-40KPa、-50KPa五种力值条件）、动态负压（0~10KPa、0~20KPa、0~30KPa、0~40KPa、0~50KPa，0.1Hz五种力值条件）、静态正压（45KPa、90KPa、135KPa、180KPa四种力值条件）、动态正压（0~45KPa、0~90KPa、0~135KPa、0~180KPa，0.1Hz四种力值条件）、以及动态正-负压（-20~45KPa、-20~90KPa、-20~135KPa、-20~180KPa、-40~45KPa、-40~90KPa、-40~135KPa、-40~180KPa，0.1Hz八种力值条件），上述共26组细胞每天以相应力学刺激条件加载1h、连续加载2天，对照组细胞则在培养装置内培养不加压相同时间。CCK-8进行细胞增殖活性检测及流式细胞术进行细胞周期检测，结果显示：特定的压力作用可促进BMSCs分裂与增殖，其中动压促增殖效应强于静压，动压中又以低负压和高正压促进效果更好，动态正-负压条件下则以-40~135KPa范围内的动压为最佳促增殖条件。根据实验二中所获得的不同压力条件对BMSCs增殖活性与细胞周期的影响，从五类26种不同压力加载条件中选取具有代表性的五类12种压力加载条件：静态负压（-20KPa、-40KPa）、动态负压（0~20KPa、0~40KPa，0.1Hz）、静态正压（45KPa、90KPa）、动态正压（0~45KPa、0~90KPa，0.1Hz）、以及动态正-负压（-20~45KPa、-20~90KPa、--40~45KPa、-40~90KPa，0.1Hz），进行后续实验的观察。实验三中采用透射电镜和激光共聚焦显微镜观察不同压力条件对BMSCs超微结构和细胞骨架的影响。结果显示：低强度（-20KPa）静态或动态负压作用下，BMSCs表现出内质网扩张、微绒毛丰富等蛋白分泌旺盛的特征，而高强度（-40KPa）静态或动态负压作用下，细胞则出现早期凋亡的表征。低强度（45KPa）静态或动态正压作用下细胞内质网轻度扩张，线粒体嵴排列较整齐，核糖体丰富，微绒毛丰富，且细胞周围可见胶原分泌。而高强度（90KPa）静态或动态正压作用下细胞出现凋亡特征，但同时伴随细胞中分泌的基质增多，提示该水平压力作用下细胞更新加速，凋亡细胞增多的同时细胞分化进程加快、分泌能力增强。细胞加载动态正-负压刺激后，仅在-40~90KPa组观察到细胞中核仁较大、内质网扩张、细胞活性较好，其余正-负压组细胞观察到不同程度细胞凋亡指征。F-actin荧光染色显示，无论静态或动态负压还是静态或动态正压均可有效地促进F-actin表达及应力纤维的装配，动态正-负压作用下也可引起应力纤维的装配，但F-actin染色强度低于动态正压及动态静压组。在实验四中我们用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示：经实验二证实具有抑制细胞增殖作用的静态负压（-40KPa）以及动态正-负压（-20~90KPa、-40~45KPa）组细胞凋亡量显著增加，分析可能由于高强度的持续压力超过了BMSCs的生理载荷，因此细胞发生了凋亡，而应力变化幅度较小的动态压力可能因作用强度不足无法引起细胞增殖、凋亡等的生物学特性的改变。在本部分结果中，经实验二证实具有促细胞增殖作用的低强度动态负压（0~-20KPa）、高强度静、动态正压（90KPa、0~90KPa）、以及特定范围正-负压（-40~90KPa）组细胞凋亡也有所增加，提示力学刺激下一定程度的细胞凋亡可能是细胞自身改建、调节的方式之一，该结果与在超微结构中所观察到的变化趋势相一致。在实验五中，我们采用Real-time PCR检测静态负压、动态负压、静态正压、动态正压、动态正-负压五类12种压力条件刺激下BMSCs中成软骨标志基因mRNA的表达量。结果显示：低强度动态及静态负压（-20KPa、0~-20KPa）显著促进BMSCs中Sox9及Aggrecan基因的表达，而高强度静态及动态负压（-40KPa、0~-40KPa）抑制成软骨基因表达；高强度静态或动态正压力（90KPa、0~90KPa）显著促进BMSCs中包括Sox9、Aggrecan以及II型胶原在内的所有成软骨指标，而低强度静态及动态正压（45KPa、0~45KPa）表现出对Sox9基因的促进作用。动态正-负压组中仅-40~90KPa压力组表现出对包括Sox9、Aggrecan以及II型胶原在内的所有成软骨指标的促进作用，而其余三种动态正-负压刺激条件随也表现出对Sox9和Aggrecan基因不同程度的刺激作用但并不能引起II型胶原基因的上调。横向比较五类不同性质的压力，以动态压力的成软骨促进作用好于静态压力，动态压力中又以0~90KPa动态正压促成软骨效果最好，其次为-40~90KPa的动态正-负压。小结：本课题自主创新成功研制出一种新型多功能体外细胞动静态正-负压加载系统，该装置具有操作简单、压力控制精度较高、温度控制稳定、压力作用模式种类多、压力作用范围宽、性能可靠等特点，在国内外首次实现在同一个细胞力学仪器上的静态负压、动态负压、静态正压、动态正压以及动态正-负压等多种压力作用方式的体外模拟。在此基础上，课题组进一步通过对不同压力条件作用下BMSCs从增殖活性、细胞周期到超微结构、细胞骨架、凋亡情况、乃至BMSCs的成软骨基因的PCR检测等多方面的分析，揭示了静态负压、动态负压、静态正压、动态正压以及动态正-负压五类12种压力条件在BMSCs的力学生物学响应，综合增殖、凋亡、骨架、超微结构及软骨向分化的检测结果，我们发现在五类12种压力条件中，低强度动态负压（0~-20KPa）、高强度静态及动态正压（90KPa、0~90KPa）以及-40~90KPa动态正-负压表现出明显促BMSCs生物学活性的作用，但0~-20KPa动态负压刺激不能促进II型胶原基因的上调、90KPa静态正压力在促进细胞增殖和软骨向分化的同时细胞凋亡也十分活跃。因此，只有0~90KPa动态正压和-40~90KPa动态正-负压表现出促进增殖、促进细胞骨架重组、凋亡稍活跃、促进各种软骨指标的上调等全面的正向促进作用，其中就促成软骨基因上调方面，0~90KPa动态正压力的效应又好于-40~90KPa动态正-负压。由于TMJ活动中变化的关节内压力使得髁突软骨所处的力学微环境较复杂，本研究所揭示的不同性质压力微环境对基于BMSCs的关节软骨再生的力学生物学效应，有望为今后TMJ髁突软骨组织工程修复的生物力学调控提供研究基础。也可为关节软骨细胞、成骨细胞、牙周膜细胞等多种压力相关细胞进行体外细胞力学研究提供有益的借鉴。

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