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双突变视紫红质蛋白（Rho-R135G/G188R）转基因斑马鱼视网膜色素变性模型的建立

作　者: 陈哲
导　师: 董方田
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 转基因模型斑马鱼视紫红质视网膜色素变性
分类号: R774.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的：建立一种视紫红质双突变-R135G/G188R暂时性(transient)转基因斑马鱼视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)模型,并检验该突变所致视网膜变性的特征。方法：将两种经基因工程改造的质粒pXOP1.3-EGFP-rho和pXOP1.3-EGFP-rho-R135G/G188R通过显微注射的方法导入野生型斑马鱼胚胎,制造出两种暂时性转基因斑马鱼(F0代),分别表达外源性的野生型斑马鱼视紫红质或其双突变体(Rho-R135G/G188R)。用活体常规荧光显微镜观察法筛选出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性的F0代转基因幼鱼。并用荧光和/或免疫荧光冰冻切片分析技术检测转基因视紫红质的水平和其在视网膜上的分布,以及视网膜变性的表现。结果：在本试验中,1.3-kb的爪蟾视紫红质启动子(Xenopus rhodopsin promoter,XOP)片段足以替代全长5.5-kb的XOP启动转基因构造表达。通过常规荧光显微镜下观察完整活体斑马鱼幼鱼眼睛荧光表达情况以及图像采集,可鉴别出成功的转基因个体：三次显微注射试验总计约1000枚胚胎中,平均约5%-7%的幼鱼呈EGFP阳性。冰冻切片分析显示,鱼卵受精后第5天(5days post fertilization,5dpf) Rho-R135G/G188R表达水平即下降,相反,对照转基因幼鱼外源性视紫红质表达水平却明显升高；结合EGFP在视网膜上的分布位置分析,可能是转入的双突变视紫红质的表达导致了视杆细胞特异性的视网膜变性,考虑到对照外源性转基因视紫红质没有引起此现象,提示视杆细胞死亡是呈R135G/G188R突变特异性的。结论：利用由细胞特异性启动子加上带有EGFP编码序列标签的两种Rho CDS片段组成的质粒,可以成功制备出两种暂时性转基因斑马鱼RP模型；该模型证实1.3-kbXOP片段是一种跨物种性的足够强的启动子,也为Ⅱ类视紫红质突变——R135G/G188R导致视紫红质蛋白折叠错误进而发生以视杆细胞死亡为表型的RP这一说法提供了支持。这些转基因斑马鱼有望作为人类视网膜色素变性遗传病的模型,以其EGFP-Rho融合蛋白为探针来揭示视网膜变性的潜在病理机制,甚至可能为探索该病的基因治疗方法提供实验材料。

全文目录

目录  3-4
中文摘要  4-5
Abstract  5-6
前言  6-11
  1. 视紫红质基因突变导致的视网膜色素变性  6-7
  2. 现有的RP模型  7
  3. 斑马鱼在制备疾病动物模型时的优势  7-8
  4. 一种卓越的活体报告子——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)  8-9
  5. 视杆细胞特异性表达启动子——XOP  9-11
材料与方法  11-29
  1. 鱼的养护  11
  2. 分子生物学  11-18
  3. 配鱼与胚胎收集  18-20
  4. 制备转基因鱼  20-25
  5. 胚胎/幼鱼孵育与荧光筛选  25-27
  6. 免疫荧光与组织学  27-28
  7. 荧光显微镜观察  28-29
结果  29-37
  1. 两种转基因质粒的制备  29-30
  2. 两种“暂时性”转基因斑马鱼的生成  30
  3. 两种转基因鱼注射后死亡率及EGFP阳性率情况  30-33
  4. 活体图像采集对转基因幼鱼的筛选  33-35
  5. 冰冻切片法观察转基因鱼眼视网膜外层区域EGFP情况  35-37
讨论  37-43
  1. 转基因斑马鱼对研究RP基因治疗的应用价值  37
  2. “暂时性”转基因斑马鱼有望生成“经典的”转基因鱼系  37-38
  3. 为什么选择R135G和G188R这两个突变位点?  38-39
  4. 用斑马鱼制备RP模型的优势  39
  5. 1.3-kb XOP生成转基因斑马鱼模型的成本更低  39-40
  6. 转基因斑马鱼生成有待改进的方面  40-43
参考文献  43-47
文献综述  47-66
  参考文献  54-66
致谢  66

双突变视紫红质蛋白（Rho-R135G/G188R）转基因斑马鱼视网膜色素变性模型的建立

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