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FasL反义寡核苷酸阻断舌鳞癌细胞免疫逃逸的实验研究

作　者: 方丽
导　师: 陈乔尔
学　校: 安徽医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 口腔鳞状细胞癌 Fas/FasL 细胞凋亡反义寡核苷酸
分类号: R739.86
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的肿瘤的发生、发展与细胞凋亡机制及机体免疫功能的异常密切相关,通过Fas/FasL系统抵抗Fas介导的凋亡并诱导免疫细胞凋亡,在肿瘤细胞的免疫逃逸中发挥着重要的作用。研究表明包括口腔鳞癌在内的许多肿瘤内都有FasL的高表达且这种高表达与肿瘤的免疫逃逸有关。本研究通过设计合成特异性的FasL反义寡核苷酸(FasL antisense oligodeoxynucleotide, FasL ASODN)转染舌鳞癌细胞,观察FasL ASODN对舌鳞癌细胞自身增殖和凋亡的影响,以及对FasL蛋白表达及mRNA水平的影响。并通过舌鳞癌细胞表面的FasL的功能检测及SCC-9与Jurkat共培养实验,探讨FasL ASODN在舌鳞癌细胞免疫逃逸中的作用及对T细胞诱导凋亡的影响。方法1、根据FasL基因序列设计合成特异的互补于mRNA起始密码区的FasL ASODN,并设同长度的与mRNA起始密码区序列相同的正义寡脱氧核苷酸(sense oligodeoxynucleotide, SODN)做对照,均经硫代磷酸化修饰,且5’端进行FAM绿色荧光标记。并用阳离子脂质体介导转染人舌鳞癌细胞。荧光倒置显微镜观察及流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度ASODN/SODN在转染前后不同时间对Tca8113细胞增殖的抑制情况；FCM测定转染前后诱导Tca8113细胞的凋亡情况,包括早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率等指标。2、FCM检测Jurkat细胞(Jurkat细胞与活化的T细胞功能相似,且高表达Fas,可作为活化的T细胞广泛应用于实验研究)表面Fas的表达：将FasL中和抗体NOK-2处理前后人舌鳞癌细胞株SCC-9细胞与Jurkat细胞共培养,探究SCC-9细胞表面FasL诱导T细胞凋亡的情况。根据预实验结果,选择0.4μmol/L的ASODN/SODN为转染的终浓度,通过脂质体介导法转染SCC-9细胞,FCM检测ASDON/SODN转染前后细胞表面FasL表达的变化,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测细胞FasL mRNA的变化,用与Jurkat细胞共培养法检测口腔鳞癌细胞诱导T细胞凋亡的变化。结果1、通过荧光倒置显微镜观察及FCM检测发现脂质体一定的情况下,在一定范围内,ASODN的浓度越高,转染效率越高。MTT结果显示FasL ASODN对Tca8113细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05),FCM对细胞凋亡的检测结果显示反义链组与正义链组、空白对照组及脂质体组相比,总凋亡率有明显差异(P<0.05)。反义链组与空白对照组及脂质体组比较,除早期凋亡率外,其余各项均有统计学意义；而与正义链组比较,只有反义链组的晚期凋亡率、总凋亡率、总死亡率三项有明显的差异(P<0.05)。2、通过流式细胞术检测Jurkat细胞表面Fas的表达率为97.6±2.95%,SCC-9细胞与Jurkat细胞共培养后能诱导Jurkat细胞凋亡,其凋亡率为61.5±2.44%；用FasL中和抗体NOK-2封闭SCC-9细胞表面的FasL后,Jurkat细胞的凋亡率降为6.32±0.56%。经FasL ASODN作用24h后SCC-9细胞FasL的表达率下降,FasL ASODN浓度为0.4μmol/L的处理组FasL的表达率为8.5±1.15%,与对照组27.7±2.54%相比均有显著差异(P<0.05);而相应浓度FasL SODN处理组FasL表达率与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。SCC-9细胞经FasL ASODN作用后FasL mRNA水平下降,以β-actin基因作内参照,ASODN组FasL mRNA的相对表达量为0.19±0.01,而SODN组分别为0.98±0.22。SCC-9细胞经FasL ASODN作用后,与Jurkat细胞共培养,Jurkat细胞凋亡率减少至18.04±1.01%,与对照组Jurkat细胞凋亡率57.08±7.43%比较有显著差异(P<0.05)。而SODN组Jurkat细胞凋亡率为57.98±6.74%,与对照组比较无显著差异。结论1、FasL ASODN对Tca8113细胞的增殖有一定的抑制作用,能够促进其凋亡。2、SCC-9细胞表达有功能的FasL,能够诱导Jurkat细胞凋亡,从而抑制T细胞的免疫功能。说明Fas/FasL途径是口腔鳞癌细胞免疫逃逸的重要机制之一,可成为免疫治疗的新靶点。3、经FasL ASODN转染的SCC-9细胞,FasL mRNA及FasL蛋白表达下降；与Jukrat细胞共培养后,Jurkat细胞的凋亡率下降。表明FasL ASODN可有效地封闭口腔鳞癌细胞FasL表达,而使其诱导T细胞凋亡的能力减弱。因此,FasL ASODN对口腔鳞癌细胞免疫逃逸的抗肿瘤作用,有望逆转口腔鳞癌细胞的免疫抑制作用为反义基因技术及细胞因子在肿瘤生物治疗中的应用提供了新的理论及实验依据。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-18
实验一 FasL反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的影响  18-29
  1 材料与方法  18-22
  2 结果  22-26
  3 讨论  26-28
  4 小结  28-29
实验二 FasL及FasLASODN在舌鳞癌细胞免疫逃逸中的作用  29-46
  1 材料与方法  29-36
  2 结果  36-43
  3 讨论  43-46
  4 小结  46
结论  46-47
参考文献  47-51
附录  51-53
致谢  53-54
综述  54-62
  参考文献  60-62

FasL反义寡核苷酸阻断舌鳞癌细胞免疫逃逸的实验研究

内容摘要

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