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探讨K1f4在鼻咽癌增殖、EMT和侵袭转移中的调控作用

作 者: 赵尊兰
导 师: 姚开泰
学 校: 南方医科大学
专 业: 肿瘤学
关键词: NPC Klf4 细胞增殖 MET 侵袭转移
分类号: R739.63
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方和东南亚常见的恶性肿瘤之一,是指发生在鼻咽粘膜的恶性肿瘤。其发病与环境、饮食、遗传以及EBV(Epstein Barr Virus)感染等因素有关,发病年龄大多为中年人,流行病学研究发现,鼻咽癌发病有地域、民族和家族聚集现象。目前NPC的治疗方法有放疗和化疗,以放射治疗为主,早期治愈率较高,但因其恶性程度高,早期既有淋巴结转移,因此就诊时往往已达中晚期,此时其治愈率却不理想。而且目前,对于NPC的具体发病机制还不是十分清楚,因此对于进一步了解NPC的发生发展以及与之相关的治疗手段值得我们深入研究。Klf4(Kruppel-like factor4)属于Klf家族,为一种真核生物中具有锌指样结构的蛋白转录因子。Klf4首先由Shields JM等于1996年被描述,他们从小鼠的NIH3T3细胞cDNA文库中分离得到该基因,因其主要在消化道表达,故又被称之为胃肠富集Klf(gut-enriched Kruppel-like factor, GKlf)。Klf4蛋白含有多个功能区域,包括N末端的富含酸性氨基酸的转录激活区,能够参与蛋白-蛋白之间的相互作用;以及c-端能与DNA结合区域结合的锌指结构区域(易与CACCC序列元件和(或)富含GC序列的靶基因调节序列结合),另外还有临近N-端锌指结构区域的转录抑制区。Klf4主要在皮肤、口腔、胃肠道上皮、血管内皮等处表达丰富。Klf4在体内多个方面发挥着重要的作用,参与正常组织细胞的增殖、分化以及凋亡等多种生物学行为,并能够维持干细胞的自我更新。Klf4通过与不同的靶基因结合,可以激活或抑制转录。在结肠上皮中,Klf4可以通过抑制细胞增殖和促进其分化来维持结肠上皮的体内平衡,另外,Klf4还是皮肤上皮分化的一个重要分子;研究发现,在血管损伤后,Klf4可以在平滑肌细胞中迅速表达上调。除此之外,在肿瘤组织中,Klf4可以通过与不同靶基因的作用,发挥癌基因或抑癌基因的作用,从而多角度的参与肿瘤的发生发展。在结肠癌中,因Klf4的甲基化和杂合性的丢失,证明Klf4在结肠癌为低表达,并且Klf4通过与APC基因结合来抑制Wnt通路从而进一步抑制结肠癌的发生;另外,更多的证据表明,Klf4同样可以抑制胃癌的发生。研究发现,Klf4在食管癌、膀胱癌和肺癌的组织中均表达降低,起抑癌基因的作用,而在乳腺癌组织中,其表达升高,发挥癌基因的作用。研究证实,Klf4表达升高为喉鳞癌的一个早期事件。研究表明,无论Klf4作为癌基因或抑癌基因,可能与不同的细胞环境、其他基因的表达模式和单个细胞染色质环境有关。迄今,Klf4在NPC发病中所发挥的作用尚不清楚,那么其在NPC中的表达情况是怎样的,又是如何参与NPC的发生发展呢?这些都值得我们进一步探讨。鉴于Klf4目前的研究现状,我们检测了NPC细胞及组织中Klf4的表达谱,基于携带Klf4的慢病毒载体建立稳定过表达Klf4的NPC细胞株,并通过检测NPC细胞株的生物学行为及EMT相关基因的变化,来阐明Klf4在NPC发生发展中所发挥的功能,同时我们还合成了下调Klf4表达的siRNA,反面验证Klf4在NPC中的作用。为此我们进行了如下研究。方法:第一章NPC细胞株和组织标本中Klf4的表达谱1.通过qRT-PCR检测CNE1、CNE2、C666-1、 HNE1、5-8F、6-1OB、SUNE1和HONE18种NPC细胞株中Klf4表达谱(以NP69作为对照)。2.收集NPC组织标本21例和慢性鼻咽炎症组织标本6例,应用qRT-PCR检测Klf4的表达谱,结果分析运用2-ΔΔCt方法进行比较。第二章Klf4对NPC细胞增殖的影响1.建立稳定过表达Klf4的NPC细胞株利用慢病毒表达载体pLenti-Klf4生产携带Klf4的慢病毒,收集病毒上清分别感染NPC细胞株5-8F、HONE1和SUNE1,48-72h后于倒置荧光显微镜下检测EGFP表达以观察感染情况,若感染效率低于90%,应用流式细胞仪分选EGFP+细胞,大量扩增细胞并保种;提取细胞RNA及蛋白,通过qRT-PCR、 Western blot检测稳定细胞株中Klf4的表达水平。2.Klf4过表达对NPC细胞体外增殖能力的影响通过CCK8实验、平板克隆和细胞周期检测细胞增殖能力改变。3.下调Klf4表达对NPC细胞体外增殖能力的影响3.1.化学合成两条Klf4siRNA,瞬时转染NPC细胞(5-8F),48h收集细胞并提取RNA及蛋白,通过qRT-PCR、Western blot检测两条Klf4siRNA的抑制效果,选取抑制效率高的一条进行后续实验;3.2.Klf4siRNA瞬时转染5-8F. HONE1,待细胞生长状态良好时,通过CCK8实验检测细胞增殖能力。4.Klf4过表达对NPC细胞体内增殖能力的影响4.1培养扩增5-8F-Klf4、5-8F-con细胞;4.2选取生长状态良好的细胞接种于裸鼠皮下,建立NPC异位移植瘤模型,进一步研究Klf4过表达对鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响。待肿瘤长径为0.5cm时隔天测量瘤径,最后计算肿瘤体积:肿瘤组织取材、固定、染色、并运用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Ki-67. BrdU和p21表达,最后统计分析。第三章Klf4对NPC细胞EMT和迁移能力的影响1.培养过表达Klf4的细胞株,Transwell小室检测细胞迁移能力改变,qRT-PCR、Western blot检测E-cadherin、a-catenin、Fibronectin、N-caherin及vimentin等EMT相关基因的变化。2. Klf4siRNA瞬时转染NPC细胞,Western blot检测EMT相关基因的变化,Transwell小室实验评价下调Klf4后细胞体外迁移能力的变化。结果:第一章Klf4在NPC细胞株和组织标本中均低表达(1) qRT-PCR检测结果显示:与NP69相比,Klf4在8株NPC细胞中的表达下调(F=34.891,p<0.001)。(2) qRT-PCR检测NPC组织标本中Klf4表达,结果显示:Klf4在NPC组织中的表达低于鼻咽慢性炎症组织(t=-2.599,p=0.015)。第二章Klf4抑制NPC细胞的增殖1.成功构建稳定过表达Klf4的NPC细胞株利用携带Klf4的慢病毒感染NPC细胞株,48-72h后于倒置荧光显微镜下检测有EGFP表达确认感染成功,随后提取细胞RNA及蛋白,qRT-PCR检测证实携带有Klf4转基因的NPC细胞株中Klf4表达升高(p<0.01)(表2-1,图2-3);Werstern blot结果显示,与对照组相比,Klf4在HONE1、5-8F两株细胞中表达均升高,但SUNE1细胞中Klf4的表达升高不明显,结果如图(2-3),上述结果提示已成功构建稳定过表达Klf4的NPC细胞(5-8F-Klf4、HONE1-Klf4)。2.Klf4过表达后NPC细胞体外增殖能力减弱稳定过表达Klf4细胞株构建完成后,通过细胞周期、平板克隆、CCK8检测细胞增殖能力改变。CCK8结果:过表达Klf4使HONE1、5-8F细胞的增殖速率均减慢(p<0.001,图2-4);平板克隆结果:Klf4过表达使HONE1、5-8F细胞的克隆形成能力降低,其克隆形成率分别降低了67%(p<0.05)和32.17%(p<0.01);细胞周期分布显示:与对照组相比,Klf4过表达使S期细胞比例减少15.43%(p<0.05),G1期细胞比例显著增高(p<0.01),该结果表明Klf4过表达可诱导细胞周期S期阻滞(图2-6)。3.下调Klf4表达后NPC细胞体外增殖能力增强3.1将化学合成的两条Klf4siRNA分别转染至NPC细胞中,48h后收集细胞RNA和蛋白,通过qRT-PCR、Western blot检测两条Klf4siRNA的抑制效果,结果显示:5-8F转染Klf4siRNA#1后,与对照组相比,Klf4的抑制效率为93.71%(p<0.001,图2-7),而转染Klf4siRNA#2后Klf4的干扰效率为87.3%(p<0.001,图2-7),提示Klf4siRNA#1的抑制效率较高,故选择Klf4siRNA#1做后续实验。3.2瞬时转染Klf4siRNA细胞培养48h后,通过CCK8实验检测下调Klf4表达后细胞的体外增殖能力,结果显示:下调Klf4后,细胞增殖能力增强(p<0.01,图2-8)。4.过表达Klf4可抑制NPC细胞体内增殖能力裸鼠皮下成瘤实验结果显示:接种5-8F-Klf4细胞的6只裸鼠中,有5只小鼠成瘤,而对照组细胞6只小鼠均成瘤,且5-8F-Klf4细胞所成肿瘤体积及瘤重明显小于对照组(p<0.05),此外,免疫组化结果发现,Klf4过表达组BrdU和Ki-67阳性的细胞的显著降低(p<0.01),而p21阳性的细胞则显著升高p<0.01)。第三章Klf4对NPC细胞EMT和迁移能力的影响1.Klf4对NPC细胞EMT的影响通过qRT-PCR、Werstern blot检测过表达Klf4细胞株中EMT相关基因的变化。qRT-PCR结果显示:在5-8F、HONE1细胞中过表达Klf4后,与对照组比较,两株细胞中E-cadherin均表达上调(p<0.05,图3-1),而在HONE1、5-8F中间质细胞标志物N-cadherin表达水平下降(p<0.05,图3-1),HONE1细胞中间质细胞标志物Fibronectin表达下降(p<0.05)。Werstern blot实验结果发现,与对照组相比,在5-8F、HONE1细胞中过表达Klf4后,E-cadherin表达上调,而N-cadherin和vimentin表达水平下降(图3-1)。下调NPC细胞株中内源性Klf4表达水平后,Werstern blot检测细胞中EMT相关基因的变化。结果显示,与对照组细胞相比(HONE1-Klf4、5-8F-Klf4), E-cadherin表达下调,而N-cadherin和vimentin表达水平升高(图3-2)。2.Klf4对NPC细胞迁移能力的影响Transwell实验结果显示:在5-8F、HONE1细胞中,过表达Klf4后,与空载细胞相比,细胞穿膜数量明显减少(p<0.01,表3-1和图3-3)。下调Klf4表达后,细胞穿膜数量比对照组增加(p<0.05,图3-4)结论:Klf4抑制NPC细胞增殖、诱导MET;并抑制NPC细胞体外迁移。

全文目录


摘要  3-9
ABSTRACT  9-16
前言  16-24
  参考文献  20-24
技术路线  24-25
第一章 NPC细胞株和组织标本中Klf4的表达谱  25-31
  1. 材料与方法  25-28
  2. 结果  28-30
  3. 结论  30
  附图  30-31
第二章 Klf4对NPC细胞增殖的影响  31-52
  1. 材料与方法  31-40
  2. 结果  40-46
  3. 结论  46-47
  附图  47-52
第三章 Klf4对NPC细胞EMT、侵袭转移的影响  52-58
  1. 材料与方法  52-54
  2. 结果  54-55
  3. 结论  55-56
  附图  56-58
第四章 讨论  58-62
参考文献  62-65
全文总结  65-66
中英文缩略词表  66-67
致谢  67-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 耳鼻咽喉肿瘤 > 咽肿瘤
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