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研究背景和目的鼻咽癌(NPC)是一种发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤。占头颈部恶性肿瘤的78.08%,占上呼吸道癌肿的92.99%。我国是鼻咽癌发病率最高的国家,而广东、广西、海南等地都是高发区,其发病率大约是25-50例每100,000人,高于西方国家25倍。由于其特殊的解剖位置,所以手术的方法受到局限,因此治疗主要依赖于放射治疗。然而,即使给予根治剂量,5年内仍有约30%的患者出现局部肿瘤复发,30%至60%的患者发生转移。肿瘤干细胞(CSC/TSC)的概念于2001年被正式提出。肿瘤干细胞具有四个重要特征：1、自我更新的能力。自我更新能力是肿瘤干细胞保持分化为前体细胞的能力。2、多分化潜能。多分化潜能使肿瘤干细胞能够产生不同分化程度的子代肿瘤细胞,在体内形成新的肿瘤。同一肿瘤组织中,分化成熟的肿瘤细胞恶性程度较低,而分化差的肿瘤细胞恶性程度高。3、高增值能力。大量实验表明,CSC/TSC比普通肿瘤细胞具有更高的增值能力。4、耐药性。多药耐药是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一。肿瘤干细胞细胞膜上多数表达ABC转运体家族膜蛋白,能够运输并排出代谢产物,药物等物质,使得许多对肿瘤非干细胞具有抑制或杀伤作用的化疗药物在肿瘤干细胞上发挥不了杀伤作用,或作用明显减弱。目前,使用干细胞表面标记ALDH1+、CD44、CD133等,可以识别乳腺、脑、肺、肝癌的干细胞。最近的一项研究表明,干细胞可以通过优先激活CHK1和CHK2的细胞周期检验点,增加DNA修复能力从而引起辐射耐受。c-MYC基因是MYC基因家族的重要成员之一,是一种可使细胞无限增殖,获永生化功能,促进细胞分裂的基因,因与多种肿瘤发生发展有关。c-MYC基因的表达一般与细胞的生长状态有关,然而在细胞分化时c-MYC表达则降低,发现c-MYC在细胞GO期到S期的过程中也起作用。表明c-MYC表达的变化与细胞的增殖及分化状态有关,其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用。MYC可以通过抑制p27激活cyclin E/Cdk2使成纤维细胞静止。以往的研究还表明,MYC可以同时激活p53和pten引起正常的和恶性干/祖细胞的分化,自我更新,及致瘤性。本研究的目的是,根据PKH26荧光染料的特性,识别具有慢周期特性的PKH26+细胞,通过明确c-MYC对CHK1/2.的直接调节作用,阐述PKH26+细胞具有辐射抗性的机制,旨在揭示c-MYC介导的DNA损伤修复在鼻咽癌放疗抵抗中的作用。方法1.细胞和培养条件本实验所用细胞均由本实验室保存。人鼻咽癌细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,于37℃、5%CO2培养箱内培养。分选后的PKH26+以及PKH26-细胞使用的是无血清的未分化培养基(MEBM; Clonetics division of Cambrex BioScience)进行维持培养。2.肿瘤球培养：将分选鼻咽癌细胞及经过不同方式处理后的细胞,置于低粘附培养板中,用含DMEM-F12培养基培养,含2%N2,2%B27,20ng/mL HGF,100ng/mLEGF, and1%真菌抗生素,悬浮于培养,观察细胞形成肿瘤干细胞球的过程。3.免疫荧光将待检测样品放入放有盖玻片的6孔板中,4%多聚甲醛固定,PBS清洗,0.5%Triton X-100破膜,PBS清洗,加入一抗37℃孵育45min, PBS清洗,洗涤后加入荧光二抗,37℃孵育45min, PBS清洗,DAPI染细胞核,在共聚焦显微镜下观察。4.细胞周期分析用胰蛋白酶消化细胞,用PBS洗涤,在悬浮在70%乙醇中,-20℃并储存过夜。随后离心,在PBS中洗涤,再悬浮在450ml的PBS和10ml,10mg/ml无DNase的RNase中,在37℃孵育45分钟。RNase处理后,溶液中加入501μl的PI,细胞在室温下孵育10分钟,避光。分析之前,通过过滤除去细胞团块,使用BDFACSDiva,对细胞周期进行了分析。5.侧群细胞检测将贴壁细胞或处理后的肿瘤细胞分离成单个细胞,离心后用PBS清洗,含2%胎牛血清的1640培基重悬,用Hoechst33342标记,标记的细胞在37℃孵育90min, PBS洗涤,重悬,检测前加入Propidium Iodide标记死细胞,采用流式细胞仪检测侧群比例。6.免疫印迹检测蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行分析,将分离的蛋白转至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封闭液中25℃2h,一抗4℃孵育过夜,PVDF膜与二抗在室温下孵育1h,采用化学发光法检测。使用以下抗体：鼠抗人cyclin D1, cyclin A, and cyclin B (1:300),鼠抗人ABCG2, CD-44, CHK1, CHK2, pCHK1, pCHK2GAPDH(1:1,000),和γ-H2AX(1：1,000)。7.克隆形成生存分析将刚分选的PKH26+和PKH26细胞进行计数,并接种于6孔培养板。在室温下,使用直线加速器(2100EX,瓦里安)进行照射,剂量率300cGy的/分钟,并培养14天。接着,将存活的克隆数目(定义为具有≥50个细胞的菌落)进行计数。8.免疫组织化学石蜡切片经脱蜡,乙醇梯度水化,抗原修复,灭活内源性过氧化物酶,一抗4℃孵育过夜,二抗25℃孵育lOmin,DAB显色,显微镜观察显色,苏木素复染核,盐酸乙醇分化,脱水,透明。9.实时定量(定量RT-PCR)表达CHK1, CHK2, c-MYC使用的Taq-Man(?) MicroRNA反转录试剂盒,TaqMan通用PCR扩增预混试剂,根据由制造商提供的说明,使用二步法进行实时定量RT-PCR测定,GAPDH作为内参归一化。10.荧光素酶检测pGL4-hRluc/TK载体购自Promega公司。选定CHK1和CHK2的启动子基因进行PCR扩增,并克隆到pGL4载体中。根据制造商提供的说明书,使用双荧光素酶检测试剂盒(Promega),检测荧光素和Renilla荧光素酶的活性。在CHK1和CHK2启动子区域,突变c-MYC基因与其结合位点,使用QuikChange多定点突变试剂盒(Stratagene公司)根据制造商提供的使用说明书对相应位点进行突变。11. c-MYC绑定位点预测和ChIP实验c-MYC在CHK1, CHK2启动子区域的绑定位点的预测使用的是Patch软件(http://www.biobase-international.com/gene-regulation)来自CNE2细胞的DNA的准备和细胞的裂解使用的是EZ-Zyme Chromatin Prep试剂盒(Millipore)。裂解后的样品是用EZ-Magna ChIP试剂盒(Millipore)。所有的步骤均按照说明书进行操作。用来做CHIP的抗c-MYC抗体来自Santa Cruz Biotechnology, Inc在CHIP分析准备完成以后,DNA样品的扩增使用的引物见正文。12.体内成瘤实验接种时细胞用100μl按1:1RPMI-1640和Matrigel悬浮,观察其成瘤情况如下,记录小鼠肿瘤发生的时间；根据公式V=1/ab2(a为长径,b为短径)计算肿瘤体积,绘制肿瘤成长曲线,肿瘤生长数周后处死动物取出肿瘤组织。13.统计方法采用统计软件Graphpad5.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组肿瘤体积比较采用两独立样本T检验；肿瘤球形成,PKH26阳性细胞和侧群比例,细胞周期,动物成瘤时间数据均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组差异,如方差齐性,多重比较采用LSD法；如方差不齐,采用Welch值,多重比较采用Dunnett T3法；在体肿瘤生长曲线的比较采用两因素方差分析(two-way ANOVA)比较各组间差异。P<0.05被认为有统计学差异。结果1.鼻咽癌中PKH26+细胞的生物学特性在不同时间段用流式细胞仪检测PKH26+细胞的比例,在第四周CNE1为2.2%,CNE2为2.8%,分选这个比例的PKH26+的细胞进行下面的实验,检测PKH26+细胞的细胞周期,发现主要处于G1期(DNA合成前期),细胞周期蛋白cyclinD1, A在PKH26+的细胞中也高表达。分别检测CNE1和CNE2细胞中的侧群比例,可以看到PKH26+的细胞中比例明显高于PKH26-的细胞。WesternBlot检测干细胞表面标记ABCG2和CD44也证实了这一点。经过照射后PKH26+的细胞肿瘤球数目明显多于PHK26-的细胞；克隆形成实验评价照射后PKH26+和PKH26-细胞的存活率,经过8Gy的照射PKH26+的细胞克隆和照射前无明显差别,而PKH26-的细胞8Gy基本上都杀死了。2.PKH126+细胞引起的辐射抗性主要是通过c-MYC过表达。给予PKH26+和PKH26-细胞8Gy的剂量,Western Blot检测pCHK1、 pCHK2、CHK1、CHK2个基因,发现经过照射PKH26+和PKH26-细胞中CHK1和CHK2磷酸化水平均提高,但是,PKH26+细胞的磷酸化活化水平明显高于PKH26-的细胞,表明PKH26+细胞表现出更大DNA损伤激活反应。免疫荧光染色发现,细胞照射后PKH26+细胞c-MYC,pChk1, pChk2表达的增加,而且这三个基因均定位于细胞核中PKH26+细胞。为了阐明c-MYC和DNA损伤反应之间的关系,我们在鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中构建了c-MYC的过表达载体。我们发现,DNA损伤相关蛋白γ-H2AX的水平大大降低。在彗星实验,显示CNE1和CNE2细胞中过度表达c-Myc基因,DNA损伤细胞的比例明显下降了。生物信息学的方法检测了CHK1和CHK2基因上游约2000bp,分别发现了三个潜在的c-MYC基因的结合位点。在CNE2中进行(ChIP)分析c-MYC的所有假定位点。研究结果表明,c-MYC是最显着绑定的位点是CHK1和CHK2的C和E位点。敲除c-MYC的可以减弱c-MYC与CHK1和CHK2的C和E位点的结合。荧光素酶报告基因检测发现c-MYC基因过表达,也可以使CHK1和CHK2的荧光素酶表达增加,突变C和E位点结果表明,突变后c-MYC基因的过度表达没有使CE位点荧光素酶的活性增加。3. c-MYC过表达增强PHK26+细胞的DNA修复能力和干性先在鼻咽癌细胞中沉默c-MYC基因,检测照射后c-MYC表达和DNA损伤反应,紧接着,在PKH26+细胞中抑制c-MYC侧群细胞比例减少,CNE1的PKH26+细胞侧群比例从32.8%降至2.4%,CNE2的PKH26+细胞侧群比例从35.67%降至2.0%。为了进一步证实我们的假设,我们收集CNE1和CNE2细胞株的PKH26+细胞进行肿瘤球形成实验,发现抑制c-MYC可以减少的肿瘤球数目。碱性彗星试验中,我们用shc-MYC处理PKH26+细胞与对照组相比,损伤明显增加。4. c-MYC基因通过调节Chk1/2介导PKH26+细胞的DNA损伤反应和抗辐射在CNE1和CNE2中抑制CHK1/2,用WB检测抑制效率。然后用彗星实验证实慢病毒载体sh-Chk1/2干扰Chk1/Chk2的表达能使PKH26+细胞DNA损伤修复能力减弱。紧接着,对PKH26+细胞进行了为了c-MYC和CHK1/2的共感染,通过克隆形成实验、Western Blot检测,发现PKH26+细胞耐放疗。此外,c-MYC基因的抑制可以引起PKH26+细胞对放射敏感.c-MYC基因介导的DNA修复取决于CHK1/2的活化。把分选的PKH26+细胞对裸鼠进行皮下注射。结合肿瘤的体积和重量,我们发现给予不同的射线治疗方式或Si-C-MYC并被没有显著的抑制肿瘤生长,si-c-MYC与放疗进行联合则可以明显抑制肿瘤生长。Western Blot检测发现与未处理的肿瘤相比,用IR和si-c-MYC处理的肿瘤c-MYC, CHK1/2,和pCHK1/2表达水平降低。我们用免疫组织化法在62例原发的鼻咽癌标本检测这些基因的表达水平,发现c-MYC基因的高表达与CHK1/2和CD44的表达水平呈正相关。结论1.鼻咽癌细胞中PKH26+的细胞群体,有许多干细胞的特性,包括细胞周期阻滞,无限的自我增殖更新能力,肿瘤形成能力。2. c-MYC结合CHK1/2的启动子调控DNA损伤检验点反应,引起鼻咽癌细胞的耐放疗。3.抑制c-MYC的或CHK1/2可以克服在体外和体内的鼻咽癌辐射抗性
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