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miR-9对鼻咽癌增殖、肿瘤干细胞“干性”、EMT和转移的调控作用及机制

作　者: 高飞
导　师: 姚开泰
学　校: 南方医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 鼻咽癌 miR-9 增殖 肿瘤干细胞 EMT 转移
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景和目的鼻咽癌是一种发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤,其恶性程度较高,且具有极强的转移能力。我国是鼻咽癌发病率最高的国家,以广东、广西、湖南、福建等南方地区为著。早在80年代初,姚开泰就提出了鼻咽癌发病的三击／多步假说,认为EB病毒（EBV）、化学致癌物和胚性击中（即遗传因素或自发突变）是构成NPC的主要病因,不仅为一系列后续研究提供了理论基础,而且对鼻咽癌的防治具有重要的实践指导意义。生活方式已被证实和鼻咽癌的发病有关,尤其吸烟不仅是个体鼻咽癌发病的危险因素,也与EB病毒血清阳性的健康男性的发病相关,吸烟能诱导EB病毒的活动。因此,鼻咽癌的发生是多因素、多基因、多阶段、多途径的。鼻咽癌治疗方法包括放射治疗、外科手术治疗、化学药物治疗、免疫和生物治疗,基因靶向治疗也为鼻咽癌的治疗提供新的前景。2011年Weinberg指出肿瘤具有自给自足的生长信号、抗生长信号的不敏感、抵抗细胞死亡、潜力无限的复制能力、持续的血管生成、组织浸润和转移、避免免疫摧毁、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常、基因组不稳定和突变十种特征,并综述了针对以上特征的靶向治疗方法。大多数实体瘤的肿瘤微环境中存在各种类型的细胞,如肿瘤细胞、炎症细胞、肿瘤干细胞等。肿瘤干细胞（CSCs）是指可以自我更新和分化成为不同表型的肿瘤细胞。肿瘤干细胞假说认为,肿瘤细胞中有一小部分细胞,导致肿瘤发生和生长,具有无限的自我更新和复制能力,并对放疗和化疗产生抵抗。不同肿瘤的肿瘤干细胞表面标记物不同。基于CSCs的特性,有效杀灭清除CSCs被认为是根治肿瘤的有效途径之一。目前针对CSCs的靶向治疗主要有靶向抑制其表面标志物,调节CSCs通路,诱导CSCs向肿瘤细胞分化,细胞治疗（如诱导生成y8T cells杀伤CSC）等。转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征,肿瘤的转移是影响患者生存期的首要因素,已成为肿瘤研究领域的热点和难点,亦是迫切要解决的重大问题之一。肿瘤转移最突出的特征是不同的肿瘤能在人体内相同或不同的部位形成转移,即肿瘤转移的组织特异性。上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质表型细胞的生物学过程,是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程,是肿瘤转移的重要阶段。miRNAs是一种小的内源性非编码RNA分子,大约由21—25个核苷酸组成,在动物和植物,它们是重要的调节分子,每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因,它们通过与其靶基因的相互作用来调节基因表达,进而调控生物体的生长发育。最近的研究表明,一些miRNA调节细胞增殖和凋亡的过程,在肿瘤的形成中是很重要的,一些miRNAs可作为癌基因或抑癌功能,miRNA表达谱可能成为肿瘤诊断的有用的生物标志物,而miRNAs可能是一个功能强大的工具,用于肿瘤的预防和治疗。研究表明,miR-9在多种人体肿瘤组织中异常表达,如miR-9在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等中表达下调,但在神经系统肿瘤中表达上调。miR-9在肿瘤细胞增殖、凋亡、EMT、侵袭、转移等方面发挥重要作用。有研究人员的基因芯片结果显示,miR-9在人NPC组织标本上表达下调,但功能不详。我们的预实验结果显示,miR-9在人NPC细胞株中表达下调,但在NPC组织标本上表达却上调：同时,miR-9过表达抑制NPC细胞体内外增殖,而miR-9过表达却促进NPC细胞发生EMT和迁移。以上这些似乎自相矛盾的实验结果促使我们去深入解析miR-9在人NPC发病中的作用及其机制。方法第一章miR-9靶向调控CCNG1抑制鼻咽癌细胞的增殖1.质粒提取试剂盒提取质粒后,NaAC、乙醇沉淀法纯化质粒。2.稳定细胞株建立包装载体PMD2G和穿梭载体PPAX2与目的质粒lipotemin2000共转染至293FT细胞,得到的病毒上清以浓度梯度方式感染细胞,嘌呤霉素2μg/ml （GIBCO）作用约2周杀死未感染细胞,或者流式细胞仪分选出成功感染的细胞。3. TRIzol--氯仿抽提法提取RNA,按照Bio-Rad逆转录试剂盒操作说明书,采用两步法逆转录,实时荧光定量PCR（Realtime qPCR）检测miRNA和基因mRNA水平的表达。Western blot检测基因蛋白水平表达。免疫组化检测组织中基因表达位置和含量。4.CCK-8法绘制细胞生长曲线,平板克隆实验观测细胞增殖情况。5.流式细胞仪细胞周期检测。6.荧光素酶活性检测：萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值验证3’-UTR靶向结合位点活性。7.皮下成瘤观测细胞在体内的成瘤和增殖情况,肝包膜异位成瘤观测细胞的成瘤和转移情况。8.统计学分析采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。荧光定量PCR各细胞株2-△△Ct比较采用单因素方差分析（One-way ANONA）;转染后miR-9表达、细胞周期、平板克隆的两组间比较及免疫组化结果采用两独立样本t检验；CCK-8生长曲线及动物实验中皮下成瘤体积比较采用析因设计的方差分析。P<0.05为有统计学差异,数值大小以均值±标准差（X±S）来表示。第二章miR-9靶向调控Hesl在鼻咽癌肿瘤干细胞干性维持中作用及机制1. TRIzol-氯仿抽提法提取RNA,按照Bio-Rad逆转录试剂盒操作说明书,采用两步法逆转录,实时荧光定量PCR（Realtime qPCR）检测miRNA和基因mRNA水平的表达。2. Western blot检测基因蛋白水平表达。3.细胞免疫荧光观察基因在细胞中表达的定位和表达水平。4.免疫组化检测组织中基因表达位置和含量。5.肿瘤球培养、SP细胞比例检测观测肿瘤细胞的“干性”。6.荧光素酶活性检测：萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值验证3’-UTR靶向结合位点活性。7.miR-9的治疗作用：皮下成瘤后,miR-9mimics通过转染试剂注射至瘤体内,观察瘤体生长情况。8.统计学分析采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。肿瘤球计数及免疫组化结果采用两独立样本t检验。P<0.05为有统计学差异。第三章c-Myc通过miR-9靶向调控Klf4促进鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移的作用1.质粒扩增提取和纯化、稳定细胞株建立、荧光素酶活性检测、Western blotting、免疫组化、细胞免疫荧光见第一、第二章。2. Transwell迁移试验、Boyden侵袭试验和划痕试验检测细胞的转移能力。3.荧光标记鬼笔环肽染色试验和激光共聚焦观察细胞骨架变化。4.扫描电镜观察细胞形态。5.细胞粘附试验和倒置显微镜观测细胞粘附能力。6.肝包膜下移植后观测移植位点的成瘤情况及远处转移情况。7.统计学分析：采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。荧光定量PCR2-ΔΔCt两两比较比较采用两独立样本t检验；Transwell和Boyden小室结果多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANONA）,两组间比较采用两独立样本t检验；细胞粘附能力比较采用析因设计的方差分析。P<0.05为有统计学差异,数值大小以均值±标准差（X±S）来表示。第四章miR-9调控鼻咽癌细胞中免疫和炎症相关基因的表达1.人类基因U133Plus2.0阵列分析基因表达谱。2.RNA提取、逆转、实时荧光定量验证芯片结果。3.统计学分析采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。荧光定量PCR各细胞株2-△△Ct比较采用两独立样本t检验。P<0.05为有统计学差异,数值大小以均值±标准差（X±S）来表示。结果第一章miR-9靶向调控CCNG1抑制鼻咽癌细胞的增殖1.miR-9在鼻咽癌细胞株中的表达我们采用实时荧光定量PCR （Real-time qPCR）检测了miR-9在NP-69、6-10B、5-8F、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表达水平。结果显示：miR-9在鼻咽癌细胞株上表达较NP-69明显下降（F=370.010,P=0.000）。2.构建稳定过表达miR-9细胞株将三质粒包装系统（LV-con或LV-miR-9, PMD2G和PPAX2）共转染至293T细胞,产生两种病毒,即空白对照（LV-con）病毒和过表达miR-9（LV-miR-9）的病毒。转染72h后,收病毒上清感染细胞CNE2、HONE1、SUNE1,48h后观察绿色荧光,嘌呤霉素杀死未感染的细胞后,用qRT-PCR检测miR-9表达情况,结果示各种细胞较对照细胞miR-9表达均显著升高（t=7.355、5.451、5.794,P=0.018、0.032、0.029）。3. qRT-PCR检测鼻咽癌细胞株瞬时转染miRNAs后miR-9的表达采用脂质体法将miR-9mimics和inhibitor及其对照mimics con和inhibitor con转染鼻咽癌细胞株。转染48h后,提取RNA,逆转录后qRT-PCR检测miR-9的表达。结果示,miR-9mimics成功使CNE2、HONE1、SUNE1中miR-9过表达（t=7.619、11.224、5.228, P=0.017、0.000、0.035）而inhibitor降低CNE2和5-8F中miR-9的表达水平（t=10.924、14.95,P=0.000、0.004）。4.miR-9抑制鼻咽癌细胞增殖4.1CCK-8和平板克隆形成实验表明miR-9抑制鼻咽癌细胞增殖我们采用CCK-8法检测细胞生长曲线,发现CNE2细胞过表达miR-9后细胞生长变慢,而抑制miR-9后细胞生长加快（P=0.000）。平板克隆形成实验示,miR-9可显著减少CNE2、HONE1、SUNE1细胞克隆形成（t=7.721、2.744、16.545,P=0.000、0.034、0.000）。以上结果表明,miR-9过表达可抑制鼻咽癌细胞增殖。4.2miR-9影响鼻咽癌细胞的周期分布为研究miR-9抑制增殖的机制,我们进一步检测了miR-9对鼻咽癌细胞周期的影响。结果显示,miR-9过表达后,CNE2和HONE1细胞呈现G0-G1期阻滞,而miR-9抑制后,G0-G1期的细胞较对照组显著减少。5.miR-9过表达抑制CNE2细胞的体内成瘤能力为研究miR-9对鼻咽癌细胞在体内增殖的影响,我们首先将过表达miR-9的CNE2细胞及其对照细胞接种至4只裸鼠背部皮下,细胞数为1×106个,接种后第34天取材。结果对照组均成瘤,而miR-9过表达组均未成瘤。接着,我们将过表达miR-9的CNE2细胞及其对照细胞的皮下接种细胞数提高至1.5x106个,接种后第21天取材。结果示,对照组均成瘤,而miR-9过表达组仅一只成瘤。此外,我们进行了肝包膜下CNE2细胞异位移植成瘤,实验组与对照组移植细胞数均为1.2x106个,接种第23天取材,发现miR-9过表达组在肝包膜下均未成瘤,而对照组全部成瘤。6.miR-9过表达抑制SUNE1细胞裸鼠皮下成瘤能力如上所述,miR-9过表达的CNE2细胞皮下成瘤能力及肝包膜下异位移植能力均显著下降。接下来我们研究了miR-9过表达的SUNE1细胞的皮下成瘤能力。将过表达miR-9的SUNE1细胞及其对照细胞接种至5只裸鼠背部皮下,细胞数为1×106个,接种后第19天取材。结果发现miR-9过表达的SUNE1细胞成瘤后瘤体较对照组显著减小（t=4.279,P=0.003）,且生长速度显著减慢（F=34.112,P=0.000）。此外,miR-9过表达组组织中BrdU+和Ki67+的细胞均较对照组的少。7. CCNGl为miR-9的靶基因我们发现在miR-9过表达的鼻咽癌细胞株中CCNG1表达下降,而抑制miR-9后,CCNG1表达升高,在皮下成瘤的瘤体组织中,miR-9过表达组的组织中CCNG1表达下降。生物信息学软件预测发现,miR-9序列5’端2-9位核苷酸与CCNG1mRNA3’端-UTR完全互补。双荧光素酶报告基因系统的检测结果表明,重组质粒wt3’-UTR和miR-9mimics共转染可显著降低荧光素酶活性,而将wt3’-UTR和miR-9inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性（t=32.542、6.238,P=0.000、0.003）。突变质粒mut3’-UTR和miR-9mimics或miR-9inhibitor共转染均未明显改变荧光素酶活性（t=0.455、0.241,P=0.673、0.821）。以上数据表明,CCNG1为miR-9的靶基因。8.miR-9靶向抑制CCNG1表达而使细胞增殖降低为探讨CCNG1是否介导了miR-9抑制鼻咽癌细胞增殖的功能,我们首先把HONE1细胞株中CCNG1沉默,以明确CCNG1表达下调是否亦抑制了细胞增殖;Western blot显示,miR-9mimics和siCCNG1均能下调CCNGl表达,而siCCNG1和miR-9mimics均能抑制细胞增殖,二者均能使细胞周期G0-G1期细胞增多（F=14.134,P=0.002）,S期减少（F=24.175,P=0.000）。为研究CCNG1是否有拮抗miR-9的周期阻滞作用,我们在过表达miR-9的HONE1细胞的基础上进一步过表达CCNG1（LV-miR-9+pCl-CCNG1）,结果示,CCNG1表达升高,细胞增殖增快,G0-G1期的细胞减少（F=93.810,P=0.000）,S期和(G2-M期细胞显著增多（F=39.597、25.712,P=0.000、0.001）。综上,CCNG1介导了miR-9抑制鼻咽癌细胞增殖的功能。第二章miR-9靶向调控Hesl在鼻咽癌肿瘤干细胞干性维持中作用及机制1.miR-9过表达显著抑制NPC CSCs的自我更新miR-9过表达可显著下调CNE2和SUNE1细胞中干性相关基因（如Nanog、Oct4和ABCG2）表达,而下调NPC细胞中miR-9表达则导致干性基因表达上调；miR-9过表达可显著降低NPC细胞中SP细胞含量,并极显著抑制NPC细胞形成肿瘤球,且过表达组所形成肿瘤球的直径小于对照细胞的（t-39.436、31.577,P=0.000、0.000）。以上结果表明,miR-9至少抑制了NPC CSCs的自我更新。2.肿瘤细胞和肿瘤细胞所培养出的肿瘤球间miR-9和Hesl表达差异为了明确Hesl与鼻咽癌肿瘤干细胞的潜在关系,我们对miR-9和Hesl在鼻咽癌细胞（如CNE2和SUNE1细胞）和由其培养出的肿瘤球间基因表达差异进行了分析。结果显示,miR-9的表达在肿瘤球和肿瘤细胞间无明显差异（t-0.765、0.653,P=0.487、0.533）,而肿瘤球中Hes1、Sox2、Oct4、Nanog和ABCG2的表达均较肿瘤细胞的高。这预示Hesl在鼻咽癌肿瘤干细胞上发挥一定的功能。3.Hesl过表达显著促进了NPC CSCs的自我更新Hesl过表达可显著上调CNE2和SUNE1细胞中干性相关基因（即Nanog和ABCG2）表达,而下调NPC细胞中Hesl表达则导致干性基因表达下调；流式细胞仪分析表明,Hesl过表达可显著增加NPC细胞（CNE2和SUNE1细胞）中SP细胞含量,而下调Hes1则显著下调NPC细胞（CNE2和SUNE1细胞）中SP细胞含量；肿瘤球形成实验表明,过表达Hes1的CNE2和SUNE1细胞较对照组的成球能力显著增强（t=14.902、20.412,P=0.003、0.000）,而抑制Hesl组的成球能力显著下降（t=14.248、18.251,P=0.000、0.000）。以上数据提示,Hes1参与了NPC CSCs自我更新的调控。4.Hesl是miR-9的靶基因既然miR-9参与了NPC CSCs自我更新的调控,其通过下游哪一个靶基因实现?我们的研究发现,miR-9过表达降低NPC细胞（即CNE2和SUNE1细胞）中Hesl表达,而下调miR-9表达则导致Hesl表达上调；CNE2和SUNE1细胞的皮下成瘤组织中,miR-9过表达组的Hes1表达下调。生物信息学软件预测发现,miR-9序列5’端2-7位核苷酸与Hes1mRNA3’端-UTR完全互补。双荧光素酶报告基因系统的检测结果表明,重组质粒wt3’-UTR和miR-9mimics共转染可显著降低荧光素酶活性,而将wt3’-UTR和miR-9inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性（t-=23.089、11.573,P=0.000、0.000）；突变质粒mut3’-UTR和miR-9mimics或miR-9inhibitor共转染均未明显改变荧光素酶活性（t==1.075、0.218,P=0.343、0.838）。以上数据表明,Hes1为miR-9的靶基因。5.Hesl介导了miR-9抑制鼻咽癌肿瘤干细胞自我更新的功能在明确Hesl是miR-9的靶基因基础上,拟进一步阐明miR-9是否通过下调Hesl表达抑制了鼻咽癌肿瘤干细胞的自我更新。Western blot结果显示,miR-9和Hesl共同过表达组中Nanog和ABCG2的表达水平较miR-9组的高,SP细胞含量较miR.-9组的高,且Hesl过表达后有效阻断了miR-9抑制肿瘤球形成的能力（F=162.277,P=0.000）。综上,miR-9抑制鼻咽癌肿瘤干细胞自我更新的功能可由其靶基因Hes1介导。6.探讨miR-9潜在的治疗价值为研究miR-9对鼻咽癌的治疗作用,我们进行了miR-9的裸鼠皮下瘤内注射实验,首次预实验中,注射miR-9Agomir组的三只裸鼠均发现沿进针方向形成空洞且迁延不愈,而对照组未见空洞（数据未展示）。第二次重复实验中使用miR-9mimics与MaxSuppressorTM In vivo RNA-LANCErⅡ共注射,结果发现miR-9可抑制瘤体生长,且部分瘤体中心出现空洞。两组分别提取组织RNA和蛋白进行分析,结果显示,实验组中miR-9成功过表达；且其靶基因CCNG1和Hes1均被抑制。此部分结果正在进行第三次实验验证。第三章c-Myc通过miR-9靶向调控Klf4促进鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移的作用1. c-Myc在鼻咽癌细胞中上调miR-9表达c-Myc过表达上调鼻咽癌细胞株中miR-9表达,而下调c-Myc则抑制miR-9表达。可见,c-Myc正向调控了鼻咽癌细胞中miR-9的表达。2. c-Myc靶向上调miR-9表达引起EMT相关基因表达变化为明确c-Myc对EMT相关基因是否有影响,我们首先行qRT-PCR检测EMT相关基因表达情况,结果显示,c-Myc过表达显著下调HONE1细胞中E-cadherin表达（t=-44.880,P=0.000）,而通过RNAi抑制c-Myc表达则升高E-cadherin表达（t=3.149,P=0.035）;此外,c-Myc无论过表达还是通过RNAi抑制c-Myc表达均在mRNA水平对N-cadherin和Vimentin表达无显著影响（P>0.05）。Western blot检测结果表明,c-Myc过表达显著下调HONE1细胞中E-cadherin表达,上调Vimentin表达,而抑制c-Myc表达则上调E-cadherin表达,并下降Vimentin表达。此外,miR-9inhibitor能阻断c-Myc对E-cadherin和Vimentin的影响,并在CNE2细胞中得到进一步验证。3. c-Myc通过上调miR-9表达促进了NPC细胞迁移和侵袭如上所述,鼻咽癌细胞中miR-9介导了c-Myc对E-cadherin和Vimentin表达的影响,接下来我们研究了c-Myc对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响及miR-9在其中所起的作用。Transwell结果显示,c-Myc促进细胞迁移（t=12.231,P=0.000）, Boyden小室结果显示c-Myc可促进细胞侵袭（t=10.000,P=0.000）,而miR-9inhibitor可阻断c-Myc促迁移和侵袭的作用（F=147.016、59.900,P=0.001、0.001）。4.miR-9对鼻咽癌细胞中EMT相关基因表达的调控作用在培养稳定过表达miR-9的细胞株过程中,发现CNE2和HONE1细胞形态发生了变化,部分细胞变得细长且触角增多,细胞失去原有的铺路石样或规整的形态,这提示miR-9过表达可能诱导了EMT。随后,在基因层面进一步明确miR-9是否确实诱发了EMT。结果表明,miR-9过表达导致SUNE1、CNE2、 HONE1、HNE1细胞中上皮相关基因E-cadherin和a-catenin表达下降,而间充质相关基因N-cadherin和Vimentin表达升高；下调miR-9表达则引起CNE2和HONE1细胞中E-cadherin表达升高,而N-cadherin和Vimentin表达下降。以上数据提示,miR-9过表达在鼻咽癌细胞上诱导了EMT。5.miR-9促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭我们进一步采用Transwell和Boyden小室明确miR-9过表达对CNE2和HONE1细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果显示,过表达miR-9的CNE2和HONE1细胞的迁移和侵袭能力较对照组的显著增强（t=6.533、10.983：13.131、12.351,P=0.000、0.000；0.000、0.000）。划痕实验亦显示,miR-9过表达可促进CNE2和HONE1细胞迁移。综上,miR-9可促进鼻咽癌细胞迁移和侵袭。6.miR-9过表达降低鼻咽癌细胞的粘附能力为研究miR-9对肿瘤细胞的粘附能力的影响,我们用0.05nM EDTA处理过表达miR-9的CNE2和HONE1细胞及其对照细胞后,miR-9过表达的鼻咽癌细胞较对照细胞粘附能力下降（F=846.528、751.057,P=0.000、0.000）,提示过表达miR-9的鼻咽癌细胞粘附降低。7.miR-9对细胞骨架的影响我们用鬼笔环肽标记法检测了miR-9过表达对CNE2和HONE1细胞细胞骨架的影响,并用扫描电镜观测了细胞的微观形态。结果显示,miR-9过表达的细胞表面纤维增粗增多,伪足增多。Western blot检测Rho酶和Rac的表达较对照的增多。提示miR-9与细胞形态改变和伪足形成等转移起始步骤相关。8.Klf4为miR-9的靶基因miR-9过表达降低NPC细胞（即CNE2和SUNE1细胞）中Klf4表达,而下调miR-9表达则导致K1f4表达上调；CNE2和SUNE1细胞的皮下成瘤组织中,miR-9过表达组的Klf4表达下调。生物信息学软件预测发现,miR-9序列5’端2-7位核苷酸与Klf4mRNA3’端-UTR完全互补。双荧光素酶报告基因系统的检测结果表明,重组质粒wt3’-UTR和miR-9mimics共转染可显著降低荧光素酶活性,而将wt3’-UTR和miR-9inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性（t=4.380、13.777,P=0.012、0.000）；突变质粒mut3’-UTR和miR-9mimics或miR-9inhibitor共转染均未明显改变荧光素酶活性（t=0.921、0.302,P=0.409、0.777）。以上数据表明,Klf4为miR-9的靶基因。9.miR-9靶向抑制Klf4进而增强鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力我们的前期研究表明,Klf4在鼻咽癌细胞中具有抑制EMT、迁移和侵袭的功能,为研究Klf4是否具有拮抗miR-9促进迁移和侵袭的作用,我们在HoNE1细胞过表达miR-9的基础上过表达Klf4,结果过表达Klf4组（LV-miR-9+LV-Klf4）的Klf4表达升高,同时迁移和侵袭能力较LV-miR-9组显著增强（F=137.015、12.438,P=0.000、0.001）。以上提示,Klf4拮抗了miR-9促迁移和侵袭的作用,即miR-9通过靶向抑制Klf4促进细胞迁移和侵袭。10. c-Myc过表达促进鼻咽癌细胞体内转移为明确c-Myc对鼻咽癌细胞体内转移的影响,我们把过表达c-Myc的CNE2细胞及对照细胞（细胞剂量：1×106/只）分别接种于裸鼠肝包膜下,每组7只裸鼠,结果示接种处全部成瘤,而发生淋巴结转移的过表达组有5/7只,而对照2/7只。第四章miR-9调控鼻咽癌细胞中免疫和炎症相关基因的表达1.miR-9引起鼻咽癌细胞中干扰素相关基因表达变化微阵列分析显示,miR-9过表达的CNE2细胞中多种IFN调节的基因如IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、PSB9HUMAN、IFIT2、TRAIL、IFIT1、 PSB8HUMAN、IRF1和B2M的表达都发生了变化。qRT-PCR进一步验证了基因芯片结果（P<0.05或0.01）。为了进一步证实miR-9对IFN调节因子的作用,我们又进行了miR-9mimics和inhibitor的瞬时转染,qRT-PCR发现miR-9mimics组中IFI44L、PSMB8、IRF5、 PSMB10、IFI27、IFIT2、TRAIL、IFIT1、IRF1、B2M和GBP1表达升高,而ISG20和AIM2表达下降。相反,miR-9inhibitor组中IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、 IFI27、IFIT2、TRAIL、IFIT1、IRF1、B2M和GBP1表达下降,而ISG20和AIM2表达则升高（P<0.05或0.01）。2.miR-9引起鼻咽癌细胞中主要组织相容性复合体Ⅰ型（MHCI）分子表达变化微阵列分析显示,miR-9过表达的CNE2细胞中多种主要组织相容性复合体Ⅰ型（MHC Ⅰ）分子如HLA-B、HLA-H、HLA-C、HLA-F、Q8WW48HUMAN、 NP001004349.1、Q6ZUW0HUMAN、O19682HUMAN和TAP1表达升高。qRT-PCR证实了HLA-B、HLA-F和TAP1表达的变化（P<0.05或0.01）。为了进一步证实miR-9对MHC1分子的作用,我们又进行了miR-9mimics和inhibitor的瞬时转染,qRT-PCR发现HLA-B、HLA-F和TAP1在miR-9mimics组中的表达升高,而在miR-9inhibitor组中表达下降（P<0.05或0.01）。3.miR-9引起鼻咽癌细胞白介素（IL）相关基因表达变化微阵列分析显示,miR-9过表达的CNE2细胞中多种IL相关基因IL20RB、 GALT、IL7、IL1B、IL11、IL1F8、IL1A、IL6和IL7R等表达发生变化,结果用qRT-PCR证实（P<0.05或0.01）。为了进一步证实miR-9对IL相关基因的作用,我们又进行了miR-9mimics和inhibitor的瞬时转染,qRT-PCR发现miR-9mimics可以显著上调一些IL相关基因（IL20RB、GALT、IL7）（P<0.05或0.01）,而下调另一些IL相关基因（IL1B、 IL11、IL1F8、IL1A、IL6、IL7R）（P<0.05或0.01）。相反,miR-9inhibitor下调IL20RB、GALT和IL7（P<0.05或0.01）,而上调IL1B、IL11、IL1F8、ILIA、IL6和IL7R（P<0.05或0.01）。结论1.miR-9靶向下调CCNG1抑制NPC细胞增殖；2.miR-9的靶基因Hesl介导了miR-9抑制鼻咽癌肿瘤干细胞自我更新的功能；3. c-Myc通过miR-9靶向调控Klf4促进了鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移；4.miR-9可调节NPC细胞中免疫和炎症相关基因表达,提示miR-9可能在炎症和肿瘤间起桥梁作用；5.miR-9靶向调控CCNG1表达抑制了NPC细胞增殖,而miR-9靶向下调Klf4表达则促进了鼻咽癌细胞EMT、侵袭和迁移,这些预示miR-9可通过靶向调控不同的靶基因在肿瘤细胞的增殖以及EMT、侵袭和转移中发挥不同的功能,这也预示了miRNAs功能的多样性和复杂性。

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摘要  3-17
ABSTRACT  17-35
前言  35-44
  参考文献  40-44
第一章 MIR-9靶向调控CCNG1抑制鼻咽癌细胞的增殖  44-74
  一 材料与方法  44-55
  二 结果  55-62
  三 讨论  62-63
  参考文献  63-65
  附图  65-74
第二章 M[R-9对鼻咽癌肿瘤干细胞的调控作用及机制研究  74-91
  一 材料与方法  74-76
  二 结果  76-80
  三 讨论  80-82
  参考文献  82-84
  附图  84-91
第三章 C-MYC通过MIR-9靶向调控KLF4促进鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移的作用及机制研究  91-114
  一 材料与方法  91-94
  二 结果  94-100
  三 讨论  100-102
  参考文献  102-104
  附图  104-114
第四章 MIR-9调控鼻咽癌细胞中免疫和炎症相关基因的表达  114-133
  一 材料与方法  114-115
  二 结果  115-124
  三 讨论  124-126
  参考文献  126-129
  附图  129-133
全文小结  133-134
附录  134-135
攻读学位期间成果  135-136
致谢  136-138
统计学合格证明  138

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 耳鼻咽喉肿瘤 > 咽肿瘤
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