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shRNA下调MTDH基因表达抑制乳腺癌细胞上皮—间质转化

作　者: 曹恒
导　师: 谢晓冬
学　校: 大连医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 异粘蛋白乳腺癌上皮-间质转化侵袭迁移
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的：全球癌症统计数据显示，乳腺癌的发病率大约占所有恶性肿瘤的23%，死亡率约占所有恶性肿瘤的14%。乳腺癌细胞通过侵袭淋巴管或者血管，导致肝、肺、脑、骨等组织器官出现转移灶，是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。近年来研究发现，上皮—间质转化（epithelial to mesenchymaltransition，EMT）在肿瘤细胞的播散和转移中也起重要的作用。EMT是一个细胞形态学上改变的过程，其特征性表现为：细胞间粘附力降低，迁移和侵袭能力增加；目前认为发生这一转化的分子基础为上皮表型标记物（例如：钙粘蛋白、角质蛋白18等）表达水平降低，而间质表型标记物(例如：波形蛋白、平滑肌肌动蛋白-α等)表达水平升高。异粘蛋白（Metadherin,也被称为AEG-1），已经被证实是多种恶性肿瘤的致癌基因，在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、以及化疗耐药等多种恶性生物学行为中起着关键作用。而关于MTDH与上皮间质转化中的相关性的研究报道尚少。本研究应用RNAi干扰技术，下调乳腺癌MDA-MB-231细胞中MTDH基因表达，以明确MTDH基因在乳腺肿瘤细胞侵袭转移中的作用及机制。方法：1.构建针对MTDH基因的干扰表达载体MTDH-shRNA和阴性对照干扰表达载体MTDH-shRNA-neg，并用脂质体转染法瞬时转染MDA-MB-231细胞，转染48h后观察细胞形态及转染效率。2.采用RT-PCR及Western blot检测MTDH在mRNA和蛋白水平上的变化情况。3.细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化，小室侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化。4.采用RT-PCR及Western blot检测上皮表型标记物E-cadherin和间质表型标记物α-SMA在mRNA和蛋白水平上的变化情况。结果：1.转染48小时后荧光显微镜观察显示：实验组和阴性对照组转染效率约70%。细胞形态学显示：空白对照组(MDA-MB-231)：细胞呈团簇状生长，细胞与细胞之间紧密连接减少，且细胞呈类似于成纤维细胞的长梭形；阴性对照组（MTDH-shRNA-neg)：大部分细胞呈梭形，少部分呈铺路石样；实验组(MTDH-shRNA)：细胞弥散状生长，呈铺路石样，典型上皮细胞表型。2.RT-PCR及Western blot结果显示：与空白对照组或者阴性对照组相比，实验组中MTDH在mRNA和蛋白水平上表达减弱，具有统计学意义。与空白对照组相比，实验组中MTDH在mRNA水平上降低41.2%，蛋白水平上降低40.3%。3.细胞划痕实验和小室侵袭实验结果显示：实验组中下调MTDH表达，可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭能力。与空白对照组相比，实验组中细胞的迁移能力降低44%，侵袭能力降低35%。4.RT-PCR及Western blot结果显示：与空白对照组或者阴性对照组相比，实验组中上皮表型标记物α-SMA在mRNA和蛋白水平上表达减弱，而间质表型标记物E-candherin在mRNA和蛋白水平上表达增加，差异有统计学意义。结论：下调MTDH基因可以促使E-candherin的表达增加，α-SMA的表达减弱，抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞发生EMT；降低肿瘤细胞侵袭和迁移的能力。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-12
材料和方法  12-20
  1.材料  12-14
  2.方法  14-20
结果  20-26
  3.1 细胞转染效率及细胞形态学  20-21
  3.2 MTDH-shRNA 下调乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 MTDH基因表达  21-22
  3.3 细胞划痕实验  22-23
  3.4 Transwell 小室侵袭实验  23-24
  3.5 下调 MTDH 表达抑制乳腺癌 MDA-MB-231 细胞发生 EMT  24-26
讨论  26-29
结论  29-30
参考文献  30-33
综述  33-41
  参考文献  38-41
附录  41-43
攻读学位期间发表论文情况  43-44
致谢  44-45

shRNA下调MTDH基因表达抑制乳腺癌细胞上皮—间质转化

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