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miR-96调控HERG1基因抑制胰腺癌增殖转移的实验研究

作　者: 冯锦
导　师: 徐泽宽
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胰腺癌 HERG1 miR-96 分子靶向治疗
分类号: R735.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

胰腺癌是当今世界第四大常见致死性肿瘤,其特征是早期发现困难,恶性程度高,放化疗敏感性差,五年生存率低。国外文献报道胰腺癌发病高峰在60岁以上,而在中国,胰腺癌发病高峰提前至40-59岁,且发病率和死亡率逐年上升,胰腺癌已成为严重危害我国人口健康的恶性肿瘤,但目前临床上尚缺乏有效的干预措施。因此,寻找胰腺癌有效的治疗手段已成为当务之急。HERG1基因是进化保守的电压门控性钾离子通道的ether-a-go-go(eag)家族成员之一,其编码的HERG1钾通道是一种特殊类型的钾通道,具有内向整流特性。最新的研究发现HERG1存在于多种肿瘤细胞株和原发性肿瘤组织中,而关于HERG1与胰腺癌的关系至今鲜有文献报道。微小RNAs (microRNA,miRNAs)是近年来发现的一类普遍存在于真核生物中的非编码性、内源性的小分子单链RNA,长约20-25个核苷酸,具有高度保守性。miRNAs主要通过与靶基因mRNA的3’端非编码区域(3’-UTR)结合互补的程度来调控靶基因的表达,进而导致靶基因mRNA的降解或者转录后翻译水平的抑制。现已有大量研究证明miRNAs的表达在肿瘤的发生、诊断和治疗中起着重要的作用。本课题计划在胰腺癌分子靶向治疗方面进行探索,拟进一步研究HERG1对胰腺癌生长、侵袭的影响及受调控机制,为胰腺癌的治疗提供新的策略。方法：HERG1促进胰腺癌增殖转移的研究1.通过免疫组化检测78对胰腺癌组织及癌旁组织中HERG1基因的表达情况,分析其与临床病理学特征的关系；2.通过western blot和RT-PCR等方法检测胰腺癌细胞株中HERG1基因的表达情况;3.通过设计干扰RNA,转染至胰腺癌细胞株PANC-1与CFPAC-1中,获得稳定沉默HERG1基因的PANC-1与CFPAC-1细胞株；4.通过MTT,transwell等方法在体外检测HERG1基因对细胞增殖,转移及侵袭能力的影响；5.通过流式细胞仪检测HERG1基因对细胞凋亡及周期的影响；6.通过裸鼠皮下成瘤及胰腺原位成瘤体内检测HERG1基因对细胞致瘤性及转移能力的改变情况。miR-96调控HERG1影响胰腺癌增殖转移的研究1.在线软件预测与HERG1相互作用的miRNAs,3’-UTR荧光素酶报告基因初筛miRNAs;2. TagMan real-time PCR检测miR-96在胰腺癌组织及细胞中的表达情况；3.体外转染miR-96模拟物及抑制物,荧光素酶报告基因实验检验miR-96与HERG13’-UTR绑定结合的关系,RT-PCR与western blot分别检测其对HERG1mRNA和蛋白水平的影响；4.构建Pre-miR-96质粒,稳定转染至胰腺癌细胞,应用MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖能力的改变；5.应用transwell检测转染后胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的改变；6.应用裸鼠皮下及胰腺原位成瘤,观察胰腺癌细胞转染后其致瘤性及体内转移能力的改变;7.通过免疫组化检测转染前后瘤组织中HERG1的表达,再次验证miR-96与HERG1的相关性。结果：HERG1促进胰腺癌增殖转移的研究1. HERG1基因在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且与胰腺癌临床分期相关。HERG1基因在胰腺癌细胞株中呈现高表达；2.通过干扰RNA技术,沉默HERG1基因表达后,胰腺癌细胞株(PANC-1,CFPAC-1)的增殖能力明显减弱；3.应用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期情况,结果发现在阻断HERG1基因后,胰腺癌细胞株(PANC-1,CFPAC-1)凋亡比率增加,G1期比例明显增多,而S期比例明显减少；4.阻断HERG1基因表达后,胰腺癌细胞株(PANC-1, CFPAC-1)迁移及侵袭能力明显下降；5.体内实验发现阻断HERG1基因后,胰腺癌细胞CFPAC-1致瘤性及体内转移能力减弱。miR-96调控HERG1影响胰腺癌增殖转移的研究1.在线软件预测结果显示miR-96, miR-105, miR-152, miR-199a-5p, miR-220, miR-329, miR-331-5p, miR-592, let-7c, let-7g可能都与HERG1相互作用,通过3’-UTR荧光素酶报告基因初筛,我们发现miR-96为HERG1最可能的相互作用的miRNA;2.miR-96在胰腺癌组织及细胞中低表达,在癌旁组织中呈现高表达；3.通过转染miR-96模拟物,抑制物及3’-UTR荧光素酶报告基因实验,证实HERG1为miR-96特异性靶基因之一；4.通过高表达胰腺癌细胞株PANC-1及CFPAC-1中miR-96, PANC-1及CFPAC-1增殖,转移及侵袭能力明显下降；5.体内实验发现高表达miR-96后,CFPAC-1细胞致瘤性及转移能力明显减弱；对瘤组织进一步免疫组化再次验证HERG1为miR-96的特异性靶基因之一。结论：1. HERG1基因在胰腺癌中高表达,并且在胰腺癌发展过程中起到癌基因的作用;2. HERG1是miR-96特异性靶基因之一；3.miR-96在胰腺癌中低表达,对HERG1降解作用减弱,从而引起胰腺癌的发展；4.高表达miR-96后,胰腺癌细胞恶性生物学活性减弱,起到抑癌基因作用,为胰腺癌的分子靶向治疗提供了一定的理论依据。

全文目录

中英文对照及縮略词表(Abbreviations)  5-8
中文摘要  8-12
Abstract  12-16
前言  16-19
第一部分 HERG1促进胰腺癌增殖转移的研究  19-49
  摘要  19-20
  材料与方法  20-35
  结果  35-46
  讨论  46-48
  结论  48-49
第二部分 miR-96调控HERG1影响胰腺癌增殖转移的研究  49-79
  摘要  49-51
  材料与方法  51-66
  结果  66-76
  讨论  76-78
  结论  78-79
全文小结  79-82
参考文献  82-93
文献综述一  93-102
  参考文献  98-102
文献综述二  102-122
  参考文献  112-122
攻读学位期间发表文章情况  122-123
致谢  123

miR-96调控HERG1基因抑制胰腺癌增殖转移的实验研究

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