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视黄酸受体α在胆管癌发生发展中的作用及机理研究

作　者: 张秋燕
导　师: 陈清西
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胆管癌 RARα 侵袭
分类号: R735.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

临床上胆管癌的发病率日益增高,且生长速度快、侵袭力强。手术加放、化疗的综合治疗已成为其治疗的主要方法,但胆管癌对放化疗敏感度低、抵抗力强,副作用明显等特点严重限制了放化疗药物的临床使用。因此,深入研究胆管癌发生发展具有重要的意义。本文主要以体外培养的三株人胆管癌QBC939、 SK-ChA-1和HCcc9810细胞为研究对象,阐明RARa参与胆管癌发生发展的分子机制,为胆管癌的基因靶向治疗提供新策略,为寻找胆管癌早期诊断指标及临床基因治疗靶点提供科学依据。本文主要运用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR等方法研究胆管癌临床标本和胆管癌细胞中RARa的表达情况。通过MTT法、细胞集落形成、裸鼠皮下移植瘤、流式细胞术PI单染、药物联用等实验研究RARa对胆管癌细胞生长、成瘤、细胞周期、耐药性产生的影响;再采用明胶酶谱、划痕及Transwell实验研究RARa对胆管癌细胞迁移侵袭能力的影响；最后通过研究RARa与Akt、Wnt信号通路间联系来阐明RARa对胆管癌细胞生长、迁移侵袭、耐药性产生等生物学行为的调控机制。研究结果表明,胆管癌组织中RARa表达量显著高于癌旁组织。RARa表达下调明显抑制胆管癌细胞DNA合成及体外增殖能力,降低细胞集落形成和裸鼠体内成瘤能力,这可能与CyclinD1表达下调及p21表达上调有关,使细胞周期阻滞在G1/S期；RARa表达下调导致MMP2的mRNA及活性下降,从而抑制胆管癌细胞迁移与侵袭能力；RARa表达下调可能通过介导多药耐药相关蛋白MDR1的表达下降来增强胆管癌细胞对5-FU的敏感性,RARa特异性激动剂AM580能显著协同5-FU的抗肿瘤作用。进一步研究发现,RARa表达下调后P-β-catenin表达升高,β-catenin、P-Akt、(S9)P-GSK-3p表达下降；GSK-3p表达不变等结果提示,RARa可能是通过调控Akt和Wnt信号通路影响胆管癌的发生发展。

全文目录

本文主要缩略表  4-5
目录  5-8
Contents  8-11
中文摘要  11-12
Abstract  12-14
1 前言  14-26
  1.1 胆管癌概况  14-19
    1.1.1 胆管癌的临床治疗  14-16
    1.1.2 胆管癌发生的分子机制  16-17
    1.1.3 胆管癌的分子生物学特性  17-19
      1.1.3.1 细胞凋亡机制  17
      1.1.3.2 细胞周期调控机制  17-18
      1.1.3.3 细胞迁移与侵袭机制  18
      1.1.3.4 细胞耐药性机制  18-19
  1.2 核受体概述  19-24
    1.2.1 视黄酸受体的结构  19-21
    1.2.2 视黄酸受体α相关辅因子  21-22
    1.2.3 视黄酸受体α的分布及其转位机制  22-23
    1.2.4 视黄酸受体α调控肿瘤发生发展的分子机制  23-24
  1.3 药物简介  24
  1.4 研究价值  24-26
    1.4.1 立题依据  24-25
    1.4.2 研究内容  25
    1.4.3 研究意义  25-26
2 材料与试剂  26-33
  2.1 实验材料与试剂  26-30
  2.2 试剂配制  30-33
    2.2.1 药品配制  30
    2.2.2 试剂配制  30-33
3 实验方法  33-43
  3.1 免疫组织化学实验  33
  3.2 细胞培养  33
  3.3 瞬时转染  33-34
  3.4 RNA提取  34
  3.5 逆转录cDNA的合成  34-35
  3.6 实时荧光定量PCR  35
  3.7 免疫细胞化学实验  35-36
  3.8 蛋白制备  36-37
    3.8.1 细胞裂解方法  36-37
    3.8.2 组织裂解方法  37
  3.9 Western blot  37
  3.10 MTT实验  37-38
  3.11 EdU体外标记细胞增殖检测  38-39
    3.11.1 EdU标记  38
    3.11.2 细胞固定化  38
    3.11.3 Apollo染色  38-39
    3.11.4 DNA染色  39
  3.12 PI单染流式细胞术  39
  3.13 细胞集落形成实验  39
  3.14 裸鼠皮下移植瘤实验  39-40
  3.15 细胞划痕实验  40
  3.16 Transwell迁移与侵袭实验  40-41
  3.17 明胶酶谱法  41
  3.18 化疗药物联用实验  41-42
  3.19 统计分析  42-43
4 结果与分析  43-62
  4.1 RARα在胆管癌组织、细胞中的表达情况  43-45
  4.2 RARα促进胆管癌细胞的体外增殖  45-51
    4.2.1 RARα促进胆管癌细胞DNA的合成  48-49
    4.2.2 RARα对胆管癌细胞周期调控的影响  49-51
  4.3 RARα促进胆管癌细胞集落形成  51
  4.4 RARα促进胆管癌QBC939细胞裸鼠皮下移植瘤的形成  51-54
  4.5 RARα对胆管癌细胞迁移与侵袭能力的影响  54-57
  4.6 RARα对胆管癌细胞耐药性的影响  57-60
  4.7 RARα调控Wnt和Akt信号通路  60-62
5 讨论  62-66
  5.1 RARα干扰后抑制胆管癌细胞生长与成瘤  62-63
  5.2 RARα干扰后MMP2表达下调抑制胆管癌细胞体外迁移与侵袭能力  63-64
  5.3 RARα干扰后下调MDR1降低胆管癌细胞耐药性  64-65
  5.4 RARα调控Wnt和Akt信号通路的分子机制  65-66
6 结论  66-67
创新点  67
展望  67-68
参考文献  68-76
在学期间发表论文  76-77
致谢  77

视黄酸受体α在胆管癌发生发展中的作用及机理研究

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