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肝癌血清核酸适配子的筛选及其鉴定

作　者: 陈文学
导　师: 张焜和
学　校:
专　业: 内科学
关键词: 原发性肝癌血清核酸适配子 SELEX 诊断
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的：晚期肝癌患者的平均生存期只有几个月,改善患者预后的关键是早期发现和早期治疗。肿瘤标志物是目前肝癌早诊的主要手段之一,但由于肿瘤细胞的异质性,AFP等经典肝癌标志物并不能满意地解决肝癌的早期诊断。近年来蛋白组学等生物高新技术的问世有力地促进了肝癌标志物的研究,发现了具有应用前景的GPC3、GP73等新标志物。因此,采用生物高新技术探索肝癌诊断新技术成为目前的研究热点。SELEX技术是一种组合化学新技术,应用该技术可从人工合成的随机单链寡核苷酸文库中筛选出能与靶分子高特异性、高亲和力的核酸适配子。适配子功能类似抗体,但某些特性优于抗体,在疾病的诊断中显示出了良好的应用前景。SELEX技术的一个突出特点是可以“盲筛”获得未知靶分子的特异性适配子。肝癌血清中含有已知和未知肝癌标志物,作为SELEX"盲筛”靶标,有可能获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配子,为肝癌诊断,特别是早期诊断开辟新途径。因此,本研究将以肝癌血清为靶标进行适配子的SELEX筛选,旨在为建立基于适配子的肝癌诊断新技术奠定基础。方法：(1)血清靶标收集：收集20例经手术和病理证实的原发性肝癌患者的术前血清,以及20例检查无异常的正常体检者的血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常混合血清(消除个体差异),用作SELEX筛选的血清靶标。(2)核酸文库及引物设计与合成：采用本课题组自行设计并一直沿用的单链随机寡核苷酸文库和引物,由生物试剂公司合成。(3)消减SELEX筛选：先用正常混合血清进行3轮消减SELEX筛选,以去除文库中与正常血清成分结合的核酸序列,即将正常混合血清与合成的文库孵育结合、聚丙烯酰胺凝胶分离并切胶回收游离核酸、不对称PCR扩增回收的核酸、聚丙烯酰胺凝胶回收并纯化单链产物并实时PCR荧光定量,以此为亚文库进行下一轮筛选。(4)肝癌血清复合靶SELEX筛选：以肝癌混合血清为靶标进行10轮左右SELEX筛选,以获得肝癌血清特异的核酸序列,即将肝癌混合血清与消减筛选后的文库孵育结合,聚丙烯酰胺凝胶分离并切胶回收结合核酸,不对称PCR扩增、切胶回收、纯化及实时PCR定量单链产物用作下一轮的文库,重复筛选。(5)分离单一适配子并进行结构分析：以最后一轮筛选后的亚文库为模板进行PCR扩增,扩增产物送生物试剂公司克隆分离核酸序列并测序,采用RNA structure4.5软件对测序结果进行二级结构的模拟分析,采用Clustal软件对适配子序列进行聚类分析,划分家族,同一家族进行同源性比对。(6)适配子的特异性分析：将梯度适配子量(2-6pmol)分别与肝癌混合血清、正常混合血清孵育,通过聚丙烯酰胺凝胶阻滞电泳观察结合情况,Quantity One凝胶分析软件测定游离适配子带的灰度值,并计算正常混合血清与肝癌混合血清游离适配子的灰度比值,评价适配子与肝癌血清结合的特异性。(7)适配子的亲和力分析：将梯度量(1-8pmol)的适配子与肝癌混合血清孵育结合、聚丙烯酰胺凝胶阻滞电泳后测定结合条带灰度值,采用Graphpad prism5.01软件测定解离常数(Kd)。(8)适配子与单个肝癌血清标本结合的特异性分析：选择代表性适配子与单个肝癌血清标本和正常血清标本孵育、聚丙烯酰胺凝胶阻滞电泳观察结合适配子与血清结合情况,测定游离带灰度值,计算其与适配子对照的比值,ROC曲线评估适配子对肝癌的诊断价值。结果：(1)肝癌混合血清适配子筛选与分离：经过3轮消减筛选,与正常血清结合的核酸减少；经过9轮正向SELEX筛选,亚文库通过克隆成功分离出209个核酸序列,它们两端序列固定,与文库序列相同,中间的序列各不相同,表明成功筛选出一组肝癌血清适配子。(2)适配子的结构特点：适配子的二级结构模拟分析显示,结构丰富,主要有口袋形、发卡形、棒形和球拍形等；序列聚类分析分析显示,适配子分为3个家族,同源性序列比对发现有多个保守基序。(3)适配子的特异性分析：多数适配子与肝癌血清的结合带明显强于正常血清,而游离带则相反,游离适配子带的最大比值在1.07～6.61之间,平均1.90±0.77,表明适配子与肝癌血清有不同程度的特异性结合。(4)适配子的亲和力分析：选择了具有明显结合条带的10个适配子进行亲和力分析,Kd值介于46nM-640nM之间,表明多数适配子与肝癌混合血清具有较好的亲和力。(5)适配子与单个血清标本的结合情况：选择了两个代表性适配子进行观察,适配子HCS-AP-9-25的ROC曲线下面积是0.969,敏感性为94.1%,特异性为94.1%,适配子HCS-AP-9-41的ROC曲线下面积是0.945,敏感性94.1%,特异性为88.2%。结论：本研究得出以下结论：(1)首次以肝癌血清为靶标进行复合靶消减SELEX筛选,并分离出200多条与文库吻合的核酸序列,表明成功建立起以血清为靶标的适配子筛选技术并筛选出一批肝癌血清适配子；(2)各适配子的中间序列各不相同,模拟二级结构非常丰富,可聚类为3个家族,每个家族都有各自的共同基序,提示适配子可能针对血清中多种不同的靶标和结合位点；(3)多数适配子与肝癌混合血清的在凝胶中的结合带明显强于正常混合血清,而游离带则相反,灰度测定结果与之一致,表明适配子与肝癌血清有不同程度的特异性结合；(4)随机分析了部分适配子与肝癌混合血清结合的亲和力,Kd值为nM水平,表明适配子与肝癌混合血清结合有较强的亲和力；(5)分析了2个代表性适配子与小样本临床血清标本的结合情况,发现均能特异性结合肝癌血清标本,初步证实对肝癌有诊断价值。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-10
目录  10-13
第1章引言  13-16
  1.1 基于血清标志物检测的肝癌诊断研究现状  13-14
  1.2 核酸适配子在疾病诊断中的应用  14-16
第2章肝癌血清核酸适配子的筛选  16-32
  2.1 材料与方法  16-25
    2.1.1 实验试剂及材料  16
    2.1.2 靶血清标本的收集  16
    2.1.3 实验仪器  16-17
    2.1.4 主要溶液配制  17-20
    2.1.5 实验方法  20-25
  2.2 结果  25-28
    2.2.1 正常混合血清消减SELEX筛选  25-26
    2.2.2 肝癌混合血清复合靶SELEX筛选结果  26-28
  2.3 讨论  28-32
第3章适配子的分离、测序和结构分析  32-51
  3.1 材料与方法  32-35
    3.1.1 实验试剂及材料  32
    3.1.2 实验仪器  32
    3.1.3 主要溶液配制  32-33
    3.1.4 实验方法  33-35
  3.2 结果  35-48
    3.2.1 适配子文库对称PCR扩增  35-36
    3.2.2 适配子测序  36-48
  3.3 讨论  48-51
第4章适配子的价值分析  51-72
  4.1 材料与方法  51-55
    4.1.1 实验试剂及材料  51
    4.1.2 实验仪器  51
    4.1.3 主要溶液配制  51-53
    4.1.4 实验方法  53-55
  4.2 结果  55-70
    4.2.1 适配子与肝癌血清结合的特异性  55-64
    4.2.2 适配子与肝癌混合血清结合的亲和力  64-66
    4.2.3 适配子与单个肝癌血清标本结合的特异性  66-70
  4.3 讨论  70-72
第5章结论  72-73
致谢  73-74
参考文献  74-78
攻读学位期间的研究成果  78-80
综述  80-89
  参考文献  87-89

肝癌血清核酸适配子的筛选及其鉴定

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