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Caveolin-1基因沉默对人张氏肝细胞辐射敏感性及DNA损伤修复的影响

作　者: 王洋
导　师: 邹伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Caveolin-1 肝细胞 辐射敏感性 DNA损伤修复
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


原发性肝癌是严重危害人类身体健康的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的前三位,故肝癌的放射治疗也受到大众的广泛关注。在临床治疗上,肝癌患者利用放射线可以部分杀死癌细胞,但是,放射线也会波及到周围正常的肝细胞,使正常肝细胞受到放射线的损伤。因此,降低正常细胞辐射敏感性,是人们关注的问题。近年来研究表明,胞膜窖(Caveolae)的标志性结构分子窖蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1),除了与多种信号蛋白分子结合,激活或抑制细胞内不同信号通路外,也参与辐射后DNA损伤修复。细胞在经放射线照射后,会造成DNA损伤,Cav-1在DNA损伤修复相关信号通路中均发挥重要的作用,但机制尚不清楚。本实验以人张氏肝细胞株CHL及本实验室前期利用RNA干扰技术建立的Cav-1基因沉默的人张氏肝CHL-CAV7细胞株为研究对象,观察X射线照射对细胞克隆存活率、细胞周期以及DNA损伤修复等相关信号转导蛋白表达的影响,探讨Cav-1与细胞放射敏感性及DNA损伤修复的关系,旨在阐明Cav-1作为细胞膜信号转导平台的标志蛋白在应对细胞放射损伤中的作用,为肝癌放射治疗提供实验依据。结果如下：(1)Cav-1基因沉默增加细胞辐射敏感性。0-10Gy X射线照射后,CHL和CHL-CAV7细胞的克隆存活率减少,CHL-CAV7细胞的克隆存活率在8Gy X射线照射后与母细胞相比显著减少；5Gy X射线照射后,CHL和CHL-CAV7细胞均发生G1期阻滞,CHL-CAV7细胞在X射线照射后G1期阻滞程度高于对照组。(2)Cav-1基因沉默降低细胞DNA损伤修复能力。5Gy X射线照射后,CHL和CHL-CAV7细胞内均有γH2AX蛋白的表达,CHL-CAV7细胞中γH2AX蛋白的表达在照射后15min与母细胞相比显著增多；5Gy X射线照射后,CHL和CHL-CAV7细胞内均有DNA损伤修复相关蛋白p-ATM及DNA-PKcs的表达,CHL-CAV7细胞中p-ATM及DNA-PKcs蛋白的表达在照射后15min与母细胞相比显著减少。(3)Cav-1通过与Mdm2结合介导DNA损伤修复。5Gy X射线照射后,CHL和CHL-CAV7细胞内Cav-1和Mdm2发生结合,CHL-CAV7细胞中Cav-1和Mdm2结合的细胞少于CHL细胞；5Gy X射线照射后,CHL-CAV7细胞内p53蛋白表达降低。结论：Cav-1基因沉默通过p53-Mdm2负性调节增加人张氏肝细胞辐射敏感性,降低DNA损伤修复能力。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
引言  9-10
1 文献综述：DNA损伤修复过程中的中心调控者-ATM  10-15
  1.1 ATM和p53  10-11
  1.2 p53和Mdm2  11
  1.3 p53和p21  11-12
  1.4 ATM和细胞周期  12
  1.5 ATM和DNA修复  12-13
  1.6 展望  13-15
2 Caveolin-1基因沉默对人张氏肝细胞辐射增敏的影响  15-29
  2.1 前言  15
  2.2 材料与方法  15-16
    2.2.1 材料与试剂  15-16
    2.2.2 主要仪器  16
  2.3 实验方法  16-22
    2.3.1 细胞培养  16-17
    2.3.2 细胞辐射处理  17
    2.3.3 集落形成实验  17-18
    2.3.4 细胞周期测定  18
    2.3.5 蛋白样品制备与定量  18-19
    2.3.6 SDS-PAGE凝胶电泳  19-20
    2.3.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot)  20-22
    2.3.8 统计分析  22
  2.4 结果  22-26
    2.4.1 Caveolin-1基因沉默增强细胞辐射敏感性  22-23
    2.4.2 Caveolin-1基因沉默抑制辐射诱导的细胞周期进程  23-24
    2.4.3 Caveolin-1基因沉默抑制辐射诱导的细胞周期蛋白的表达  24-26
  2.5 讨论  26-27
  2.6 小结  27-29
3 Caveolin-1基因沉默对人张氏肝细胞DNA损伤修复的影响  29-44
  3.1 前言  29-30
  3.2 材料与方法  30-31
    3.2.1 材料和试剂  30
    3.2.2 主要仪器  30-31
  3.3 方法  31-32
    3.3.1 细胞培养  31
    3.3.2 细胞辐射处理,  31
    3.3.3 免疫细胞化学  31-32
    3.3.4 蛋白质免疫印迹  32
  3.4 结果  32-40
    3.4.1 Caveolin-1基因沉默增加辐射诱导的DNA双链断裂  32-35
    3.4.2 Caveolin-1基因沉默抑制辐射诱导的损伤修复通路的激活  35-39
    3.4.3 Caveolin-1基因沉默增加辐射诱导的应激通路的激活  39-40
  3.5 讨论  40-42
  3.6 小结  42-44
结论  44
论文创新点  44-45
参考文献  45-51
附录A 缩略语表  51-52
附录B 肿瘤干细胞的信号转导通路  52-59
  一、肿瘤干细胞的发现及特征  52-53
  二、肿瘤干细胞的生长调控信号转导  53-55
    1、肿瘤干细胞与Wnt信号通路  53-54
    2、肿瘤干细胞与Notch信号通路  54
    3、肿瘤干细胞与Hedgehog信号通路  54-55
    4、肿瘤干细胞与其它信号分子  55
  三、展望  55-56
  参考文献  56-59
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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