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miR-141对肝癌细胞Huh7迁移和对HCV复制能力影响的机制研究
作 者: 徐正红
导 师: 杨红枚
学 校: 华中科技大学
专 业: 病原生物学
关键词: miR-141 肿瘤迁移 肝细胞癌 Huh7 转化生长因子 HCV复制 干扰素β
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
目的: microRNA(miRNA)是类非编码的单链小RNA分子,长度为18-22个核苷酸,具有转录后调控基因表达的功能。研究表明,miRNA几乎在所有细胞的生物学过程包括代谢、生存、分化和凋亡中发挥着关键性的作用。特定miRNA的表达下调导致多种疾病,尤其是肿瘤的发生发展。我们及其他研究表明,在肝癌组织中miR-141表达明显下调,但其具体作用机制尚无报道,我们研究目的之拟对肝癌细胞Huh7迁移能力是否受miR-141的调控进行初步探讨,以期提供肝癌转移的新标向,具有重要的研究意义。HCV的慢性感染容易导致肝硬化和肝癌,在中国,HCV感染率呈逐年上升趋势。据研究报道,不同的miRNA能促进或抑制病毒的复制,但miR-141对HCV复制的影响目前尚不清楚,我们的研究目的之二拟探讨miR-141对HCV复制的影响及其机制,以期探索临床上治疗HCV感染的新靶点,具有重要的临床价值。方法:1.利用慢病毒载体感染Huh7,建立稳定高表达miR-141的Huh7-miR-141-LV及其阴性对照组Huh7-NC-LV;2. Transwell Assay检测miR-141在Huh7内高表达和被抑制后,对细胞迁移能力的影响;3. qRT-PCR检测miR-141在Huh7内高表达后对JFH1复制的影响;4. qRT-PCR及Western Blot分别检测细胞TGF-β、TLR/IRF信号通路中相关分子及MMP2/MMP9在mRNA水平及蛋白质水平的表达量;5.双荧光素酶报道基因检测IFN-β Luc的活性。结果:1.利用慢病毒载体感染成功建立了稳定高表达miR-141的Huh7-miR-141-LV。2. miR-141在Huh7中高表达后能显著抑制Huh7迁移,而被抑制后,Huh7的迁移能力上升,因此miR-141是影响Huh7迁移能力的个重要的因素。3.在Huh7中高表达miR-141后,可通过降低其靶基因TGF-β R1的mRNA水平和蛋白质水平的表达量,阻断TGF-β信号通路,进而抑制Huh7的迁移能力;在Huh7中高表达miR-141后,还可降低MMP2和MMP9的表达量。4. miR-141在Huh7中高表达后能显著抑制HCV毒株JFH1的复制能力,并成时间依赖性。5.在JFH1感染Huh7-miR-141-LV后,可促进TLR/IRF信号途径中的TLR7、TLR9、IRF7的mRNA水平和IRF3的蛋白质水平。6.在JFH1感染前后,Huh7-miR-141-LV中IFN-β Luciferase的活性都比Huh7-NC-LV中强,因此miR-141可能通过促进TLR7、TLR9和IRF3、IRF7的表达,激活IFN-β启动子,从而抑制JFH1在Huh7中的复制能力。结论:1. miR-141在Huh7中高表达后,通过TGF-β R1阻断TGF-β信号通路影响Huh7的迁移能力。MMP2和MMP9能促进肿瘤细胞的迁移,而miR-141在Huh7中高表达后,可明显降低MMP2和MMP9的mRNA水平和蛋白质水平的表达量,但miR-141对MMP2和MMP9的具体作用机制尚不清楚,还需进步深入研究。2.在病毒感染细胞后,激活TLR/IRF信号通路,进而诱导I型干扰素IFNα/β的表达,引起细胞的抗病毒免疫应答。miR-141可能通过促进TLR7、TLR9和IRF3、IRF7的表达,激活IFN-β的启动子,进而抑制JFH1在Huh7中的复制能力。TLR7、TLR9、IRF3和IRF7均不是miR-141的直接靶点,因此miR-141对TLR7、TLR9、IRF3和IRF7的作用机制还需实验进步确定。
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全文目录
摘要 5-7 ABSTRACT 7-11 1 绪言 11-18 第一部分 miR-141 对肝癌细胞 Huh7 迁移能力的影响 11-14 第二部分 miR-141 对 HCV 复制能力的影响 14-18 2 实验研究 18-56 2.1 实验材料 18-20 2.2 实验装置 20-22 2.3 实验方法 22-43 第一部分 miR-141 对肝癌细胞 Huh7 迁移的影响 22-34 2.3.1 细胞培养 22 2.3.2 TRIzol 法提取细胞 RNA 22-23 2.3.3 PCR(Polymerase Chain Reaction) 23-25 2.3.4 建立稳定高表达 miR-141 的 Huh7-miR-141-LV 25-26 2.3.5 miR-141 inhibitor 抑制细胞内 miR-141 的表达量 26-27 2.3.6 Transwell Assay 27-28 2.3.7 qRT-PCR 检测 TGF-β信号通路中相关分子 mRNA 的表达水平 28-30 2.3.8 Western Blot 30-34 第二部分 miR-141 对 HCV 复制能力的影响 34-43 2.3.9 病毒制备 34-37 2.3.10 qRT-PCR 检测 miR-141 对 JFH1 复制能力的影响 37 2.3.11 PCR 检测细胞内 TLR/IRF 信号通路中相关分子 mRNA 表达水平 37-39 2.3.12 Western Blot 39 2.3.13 提取 IFN-β Luciferase 质粒 39-41 2.3.14 双荧光素酶报告基因检测 JFH1 感染细胞后,IFN-β Luc 的活性 41-43 2.4 实验结果 43-56 第一部分 miR-141 对肝癌细胞 Huh7 迁移的影响 43-51 2.4.1 qRT-PCR 检测 miR-141 在正常组织和肝癌细胞中的表达量 43-44 2.4.2 用慢病毒载体感染 Huh7,建立稳定高表达 miR-141 的 Huh7-miR-141-LV 和其阴性对照组 Huh7-NC-LV 44-45 2.4.3 Transwell Assay 45-47 2.4.4 TGF-β信号通路中相关基因的表达量 47-50 2.4.5 基质金属蛋白酶 MMP2、MMP9 的表达情况 50-51 第二部分 miR-141 对 HCV 复制能力的影响 51-56 2.4.6 JFH1 在 miR-141 高表达前后的细胞中的复制时间曲线 51-52 2.4.7 TLR 信号通路中 TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表达情况 52-53 2.4.8 检测 IRF3、IRF7 的表达量 53-55 2.4.9 双荧光素酶报道基因检测 Huh7 高表达 miR-141 前后 IFN-β启动子对 JFH1 感染的应答 55-56 3. 讨论 56-61 参考文献 61-66 综述 66-76 参考文献 72-76 致谢 76
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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