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褐藻多糖硫酸酯诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡及机制研究

作　者: 杨丽丽
导　师: 邹向阳
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 褐藻多糖硫酸酯 SMMC-7721细胞氧化应激内源性途径
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：细胞凋亡机制的研究是20世纪90年代生命科学的研究热点之一。细胞凋亡对生物个体的正常发育，自稳态的维持，免疫耐受的形成，肿瘤监控等多种生理及病理过程具有重要意义。细胞凋亡机制很复杂，其中caspase依赖性的凋亡途径主要有两条途径：由死亡受体起始的外源途径和由线粒体起始的内源途径。大量研究表明线粒体和细胞凋亡密切相关，内源途径中线粒体处于核心地位。近年来研究表明：肿瘤细胞凋亡过程中有GSH (Glutathione，还原型谷胱甘肽)耗竭现象，导致细胞中ROS (Reactive Oxygen Species，活性氧自由基)在细胞中积蓄，过量的ROS作为细胞信号分子，通过多种途径传递死亡信息，诱导细胞凋亡[1-3]。线粒体是内源氧自由基的主要来源，线粒体作为细胞凋亡中较敏感的细胞器，在凋亡的中心作用已被确认，但线粒体与人肝癌SMMC-7721细胞的关系尚未阐明。因此，以线粒体作为研究的核心，研究线粒体与SMMC-7721细胞氧化损伤及凋亡的关系，从而为进一步的深入研究奠定基础。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是源于海洋褐藻和棘皮动物的一类富含岩藻糖和硫酸酯基的水溶性杂聚糖。天然多糖能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，减少化疗引起的并发症，对正常组织细胞毒性较小，具有潜在的应用价值。本课题以体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，采用形态学、细胞生物学、免疫细胞化学以及分子生物学等方法，研究Fucoidan诱导细胞线粒体损伤和细胞凋亡的机制。方法：1.采用乙醇分级沉淀法纯化褐藻多糖硫酸酯，通过苯酚-硫酸法、硫酸钡比浊法、硫酸-咔唑法、尺寸排阻色谱柱法、旋光度法测定了Fucoidan的总糖含量、硫酸根含量、糖醛酸含量、分子量和旋光度。2.采用MTT的方法检测不同浓度的褐藻多糖硫酸酯处理人肝癌SMMC-7721细胞不同时间后，细胞存活率的变化。AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，PI单染测定细胞周期变化情况。3.采用Hoechst33258染色观察细胞凋亡后核形态学的变化，透射电镜观察细胞超微结构的改变。4．采用流式细胞术检测MMP和ROS的变化情况。透射电镜观察线粒体超微结构和数目变化趋势。5.利用ELISA方法和比色法检测细胞浆中Cyt C的含量和caspase-3，caspase-8，caspase-9的活性。6.利用Western blot方法检测经Fucoidan处理的SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax在蛋白水平的表达，RT-PCR法检测livin和xiap在mRNA水平表达的变化。7.分光光度法测定细胞内MDA、GSH、SOD活性、T-AOC的变化结果：1. Fucoidan的提纯得率为34%。其总糖含量、硫酸根含量、糖醛酸含量、分子量和旋光度分别为79.14%、21%、10.895%、10.44×104Da和0.99°(20℃)。2. MTT结果显示Fucoidan处理后细胞存活率下降并且呈浓度及作用时间依赖关系。其中72h抑制细胞生长效果最明显，500μg/mL和1000μg/mL推测是最佳作用浓度。AnnexinV/PI双标记流式测定对照组、500μg/mL和1000μg/mL Fucoidan各组凋亡率分别为15.1%、18.2%和40.3%。3.凋亡细胞核染色质浓缩、高度凝集、边缘化甚至出现核碎裂等现象。透射电镜观察到细胞间隙变大，微绒毛样突起减少甚至消失、细胞核形态不规则、凝集并边聚。4.细胞线粒体跨膜电位去极化，线粒体数量较少，呈现肿胀现象，细胞内ROS蓄积。5. ELISA法和免疫荧光结果显示：Cyt C释放，细胞浆中的Cyt C含量增加，caspase-3，caspase-8，caspase-9活性增加，其中浓度为1000μg/mL时caspase-3活化最为显著。6. Western-Blot结果显示Fucoidan能通过下调Bcl-2和上调Bax促进线粒体外膜通道的开启，RT-PCR结果表明抑制凋亡蛋白家族livin和xiap的mRNA水平显著下降。7.细胞中SOD活性降低(P<0.05)，GSH耗竭(P<0.01)，MDA含量显著增加(P<0.01)，同时细胞T-AOC显著下降。结论：Fucoidan能够诱导SMMC-7721细胞凋亡，与GSH耗竭、ROS蓄积、T-AOC下降、SOD活性降低、MDA水平升高、Bcl-2表达下调、Bax表达上调、livin和xiap mRNA水平下降、caspases活化等有关，以ROS介导的内源凋亡途径为主。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-13
材料和方法  13-25
  实验对象  13
  试剂与药品  13-15
  实验方法  15-25
结果  25-37
  一、Fucoidan 纯化与分析结果  25-26
  二、细胞凋亡的检测  26-35
  三、细胞中氧化还原能力检测  35-37
讨论  37-41
结论  41-42
参考文献  42-46
综述  46-60
  参考文献  55-60
附录  60-62
攻读学位期间发表论文情况  62-63
致谢  63-64

褐藻多糖硫酸酯诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡及机制研究

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