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HBx蛋白过表达诱导肝癌细胞ER应激及MANF对肝癌细胞生物学行为的影响

作　者: 陆鹏
导　师: 沈玉先
学　校: 安徽医科大学
专　业: 神经生物学
关键词: HBV 内质网应激 HBx 肝癌 MANF
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 22次
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内容摘要


HBV(hepatitis B virus，HBV)感染易引起慢性肝炎，部分最后转化成肝癌。最近研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）参与了肿瘤的发生和发展，但作用机制仍不明确。HBV是嗜肝DNA病毒家族的溶原性病毒，其基因组呈松弛环状双链结构，含4个开放读码框架(open reading frame，ORF)，其中X区编码产物(hepatitis B virus X protein．HBx)蛋白是一种多功能的调节蛋白，在胞内信号转导、病毒复制转录、细胞增殖与凋亡、细胞周期进程、蛋白降解和肝细胞的遗传稳定性等方面均有确切作用。鉴于HBx蛋白在慢性肝脏疾病发生发展中也发挥重要的作用，因此最近相关方面的研究很多。ER应激是真核细胞的一种保护性应激反应，它是通过激活未折叠蛋白反应（unfolded proteinresponse，UPR）通路，以此来减少细胞内蛋白的异常聚集，起到细胞保护作用。研究表明它与很多因素所致疾病的发生发展密切相关。MANF (mesencephalicastrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)基因是我们从30000个基因中筛选出来的并对ER应激最敏感的基因，它是一种分泌性蛋白，ER应激能诱导其表达上调。我们推测，MANF很可能在肝炎到肝癌的转变中起着重要的作用，本文将对此进行相关的研究。目的：建立稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的HepG2稳转细胞系，并检测HBx蛋白过度表达对HepG2细胞生物学活性的影响，同时对ER应激最敏感的基因MANF在肝癌发生发展中所起的相关作用进行研究。方法：采用RT-PCR法从HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段，构建pcDNA3.1-HBx真核表达质粒，利用脂质体将pcDNA3.1-HBx转染人HepG2细胞系，通过G418筛选后，经Western blot法对HBx的表达进行验证。用MTT法检测稳转细胞的增殖活性；用PCR法检测HBx过表达引起ER应激相关基因表达的变化；选择其中变化明显的MANF基因并将其用siRNA敲低，用MTT法检测瞬转细胞的增殖活性，用transwell迁移实验和transwell侵袭实验检测瞬转细胞的迁移和侵袭能力的变化。结果：1.建立稳定表达pcDNA3.1-HBx蛋白的细胞系1.1PCR扩增HBx基因采用RT-PCR法从HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段，将扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，约在500bp处可见明显的扩增产物条带，扩增的片段大小和理论预测值相符。1.2重组质粒阳性克隆的筛选及鉴定将上述得到的PCR产物进行胶回收，然后与pcDNA3.1载体分别进行双酶切，限制酶为EcoR I和Hind Ⅲ。酶切后将胶回收产物连接到pcDNA3.1载体上，连接后的产物在DH5α感受态细胞中进行转化，筛选单克隆提取质粒后再使用EcoR I和Hind Ⅲ酶切鉴定，在465bp处有明显的条带，与基因PCR产物的大小一致。并将该质粒送到公司测序，测得的序列在基因数据库里用BLAST对比，检测结果与预期序列一致，提示重组表达质粒pcDNA3.1-HBx构建成功。1.3Western blot检测稳转细胞内HBx蛋白的表达将构建的pcDNA3.1-HBx转染HepG2细胞，用G418（0.5μl/ml）维持筛选，以建立稳转细胞系。提取蛋白质进行免疫印迹检测，检测到HBx蛋白表达的细胞表示稳转成功。2. HBx对HepG2细胞具有促增殖作用MTT法检测各组细胞OD值发现，过表达pcDNA3.1-HBx后的HepG2细胞增殖能力明显增加，表明HBx可能对HepG2细胞具有促增殖作用。3.携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞增殖活性的检测MTT法检测HepG2和HepG2.2.15细胞时发现，HepG2.2.15细胞的增殖活性与HepG2无显著性差异。可能是因为HepG2.2.15中转染的是HBV的全基因组，其对细胞的增殖调节比较复杂，表现出来的是综合结果。至于真正的原因还需要进一步的研究。4. HBx蛋白对ER应激相关基因表达的影响选取ER应激相关基因，检测其在过表达HBx蛋白的HepG2细胞中的表达情况，结果发现，PERK、BiP、MANF、ATF6和XBP1在稳转HBx蛋白的HepG2细胞中表达升高，而IRE1、CHOP和EIF2则表达降低。这些结果提示，HBx蛋白能引起ER应激相关基因表达变化。考虑到MANF对HBx蛋白的反应比较敏感，接下来的实验重点研究MANF在肝炎到肝癌发展过程中的作用。5. MANF对肝癌细胞生长和迁移的抑制作用5.1过表达MANF对肝癌细胞增殖活性的影响我们前期的研究发现，在HBV感染的肝硬化中，MANF表达增加，而在HBV阳性的肝癌组织中，MANF的表达反而降低。前面的研究结果也显示，HBx可以上调MANF的表达。上述结果提示，MANF在HBV感染的肝癌中发挥一定的作用。为了澄清MANF对肝癌细胞恶性生物学行为的影响，我们首先将MANF-FLAG质粒转染到肝癌细胞中，用MTT法检测转染前后细胞活性的变化。结果发现，过表达MANF对不同类型的肝癌细胞影响不同，过表达MANF可抑制SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15细胞及稳转HBx细胞的增殖，5.2MANF siRNA的验证将MANF siRNA转染到HepG2细胞中，同时与未转染的HepG2细胞和转染空载体的HepG2细胞进行比较，其中转染MANF siRNA的HepG2细胞MANF表达量明显降低，说明MANF siRNA能有效地抑制内源性MANF的表达。5.3沉默MANF引起肝癌细胞增殖活性增加将MANF siRNA转染到SMMC-7721细胞中，同时转染空载体作为对照。转染后36h，用MTT法检测细胞的增殖活性。除此之外还检测HepG2.2.15，HepG2，HepG2-HBx等肝癌细胞系。结果发现，与转染空载体的SMMC-7721细胞比较，转染MANF siRNA的细胞增殖活性明显增加(P<0.01)，提示MANF可能对肝癌的增殖起到抑制作用。5.4沉默MANF对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响将MANF siRNA转染到肝癌细胞中，观察相关特性变化。结果发现，敲低MANF可促进SMMC-7721、HepG2.2.15及表达HBx的HepG2细胞的增殖。transwell实验也证实了转染MANF siRNA可提高肝癌细胞的迁移率和侵袭率，提示MANF对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭有抑制作用。结论：HBx可以引起HepG2细胞增值活性提高；HBx可以差异性调节ER相关基因；MANF对肝癌细胞生长、迁移和侵袭起抑制作用。

全文目录


英文缩略词表  8-10
中文摘要  10-14
Abstract  14-18
1 前言  18-20
2 实验材料  20-25
  2.1 细胞株、菌株及质粒  20
  2.2 抗体  20
  2.3 主要试剂来源及配制  20-22
  2.4 引物  22-23
  2.5 实验仪器  23-25
3 实验方法  25-37
  3.1 重组质粒的构建及质粒提取  25-30
    3.1.1 引物设计和合成  25
    3.1.2 PCR 扩增  25-26
    3.1.3 凝胶回收  26
    3.1.4 酶切  26-27
    3.1.5 连接  27
    3.1.6 DH5α感受态细胞的制备  27
    3.1.7 质粒转化  27-28
    3.1.8 质粒的小量提取  28
    3.1.9 重组质粒的鉴定  28-29
    3.1.10 质粒的中量提取  29-30
    3.1.11 质粒图谱  30
  3.2 细胞培养及转染  30-32
    3.2.1 细胞复苏，传代与冻存  30-31
    3.2.2 肿瘤细胞培养  31
    3.2.3 细胞瞬时转染  31
    3.2.4 细胞稳定转染  31-32
    3.2.5 细胞计数  32
  3.3 蛋白免疫印迹（Western blotting，WB）  32-34
    3.3.1 蛋白样品制备  32-33
    3.3.2 SDS-PAGE 凝胶制备  33
    3.3.3 上样电泳  33-34
    3.3.4 转膜  34
    3.3.5 封闭  34
    3.3.6 曝光，显色  34
  3.4 RT-PCR  34-36
    3.4.1 RNA 提取  34-35
    3.4.2 RT 反应  35
    3.4.3 PCR 扩增  35-36
  3.5 细胞活力测定(MTT)  36
  3.6 Transwell 迁移实验  36
  3.7 Transwell 侵袭实验  36-37
  3.8 统计学处理  37
4 结果  37-45
  4.1 PCR 扩增的 HBx 基因  37-38
  4.2 重组质粒阳性克隆的筛选及鉴定  38
  4.3 Western blot 检测稳转细胞内 HBx 蛋白的表达  38-39
  4.4 HBx 对 HepG2 细胞增殖活性的影响及 HepG2 细胞和HepG2.2.15 细胞增殖活性比较  39-40
  4.5 HBx 蛋白对 ER 应激相关基因表达的影响  40
  4.6 过表达 MANF 对肝癌细胞增殖活性的影响  40-41
  4.7 MANF siRNA 的验证  41
  4.8 沉默 MANF 对肝癌细胞增殖活性的影响  41-44
  4.9 沉默 MANF 对肝癌细胞迁移能力的影响  44-45
  4.10 沉默 MANF 对肝癌细胞侵袭能力的影响  45
5 讨论  45-48
6 结论  48
7 本研究的创新点  48
参考文献  48-53
个人简历  53-56
致谢  56-57
综述  57-73
  参考文献  65-73

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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