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乙肝病毒癌基因HBx与细胞癌基因RMP的协同致癌作用及其分子机制

作　者: 王琦
导　师: 魏文祥
学　校: 苏州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: RMP HBx 细胞凋亡 细胞周期 DNA损伤
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：通过乙肝病毒癌基因HBx与细胞癌基因RMP在HepG2肝癌细胞株中的共表达,探索HBx与RMP的协同致癌作用,探讨两者在协同导致肝癌发生和发展中的分子机制。方法：1.CCK-8检测HBx和RMP对肝癌细胞增殖的影响。2. qRT-PCR和Western blot检测HBx和RMP在肝癌细胞中的表达。3.流式细胞术检测各组细胞凋亡及细胞周期的改变。4. qRT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡和周期相关基因及蛋白的表达。5.彗星电泳检测各组细胞DNA损伤的改变。6.裸鼠皮下移植瘤实验,观察HBx和RMP对移植瘤生长的影响；7.HE染色观察裸鼠移植瘤细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中HBx、RMP、AFP、Bcl-2、Bax和Bad蛋白的表达。8.免疫组化法检测人肝癌组织及癌旁组织HBx和RMP的表达9. qRT-PCR和Western blot检测HBx剂量效应对内源性RMP表达的影响。10.共聚焦激光扫描显微镜观察HBx和RMP在细胞内的定位情况。11.免疫共沉淀探讨HBx和RMP在细胞内的结合情况。结果：1.CCK-8检测细胞增殖,结果显示HBx和RMP共表达可以促进肝癌细胞的增殖。2. qRT-PCR和Western blot检测HBx和RMP在HepG2细胞中的mRNA和蛋白成功共表达。3.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的改变,显示HBx和RMP共表达可以抵抗辐照引起的细胞凋亡和G2/M期阻滞。4. qRT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡和周期相关基因及蛋白的表达,显示HBx和RMP共表达可能通过下调凋亡基因p53、Caspase-3、Bax和上调抗凋亡基因Bcl-2的表达实现对细胞凋亡的抵抗,上调Cyclin B和CDK1和下调p21的表达实现对G2/M期的阻滞。5.彗星电泳结果显示RMP对急性DNA损伤有良好的抵抗效应。6.裸鼠皮下移植瘤实验结果显示HBx和RMP共表达能促进移植瘤生长加快。7.HE染色显示HBx和RMP共表达的移植瘤细胞增殖增多,免疫组化结果显示AFP、Bcl-2表达量显著升高,Bax、Bad表达显著降低。8.免疫组化法检测人肝癌组织HBx和RMP的表达高于对应的癌旁组织。9.HBx剂量效应结果显示RMP与HBx在表达量上无直接相互影响。10.共聚焦激光扫描显微镜观察HBx与RMP在细胞内主要分布在胞浆并有部分的定位重合。11.免疫共沉淀结果显示HBx与RMP在细胞内有部分能结合形成复合体。结论：1.HBx和RMP能协同促进肝癌细胞增殖,协同抵抗60Coγ射线照射引起的细胞凋亡和G2/M期阻滞,影响细胞凋亡和周期相关关键因子的表达,能促进体内移植瘤的形成及生长,促使肿瘤细胞走向存活,进而两者可能在肝癌发生发展过程中起着重要的作用。2.HBx和RMP在表达量上无直接相关性,但在细胞内能共同定位及相互结合形成复合物,提示这种结合关系可能在引起两者协同致癌的作用中至关重要。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
第一部分 RMP和HBX共同促进肝癌的发生  13-43
  1 材料与方法  14-25
    1.1 材料  14-15
    1.2 主要仪器设备  15-16
    1.3 实验方法  16-25
  2 实验结果  25-41
    2.1 RMP与HBx对肝癌细胞增殖的影响  25-26
    2.2 RMP与HBx在肝癌细胞中的表达  26-28
    2.3 RMP与HBx对肝癌细胞凋亡的影响  28-29
    2.4 RMP与HBx对凋亡相关基因和蛋白表达的影响  29-31
    2.5 RMP与HBx对DNA损伤的影响  31-33
    2.6 RMP与HBx对肝癌细胞周期的影响  33-34
    2.7 RMP与HBx对G_2/M期检测点相关基因表达的影响  34
    2.8 HBx对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响  34-36
    2.9 RMP对HBx诱导的裸鼠肝癌移植瘤生长的影响  36-39
    2.10 HBx对RMP诱导的裸鼠肝癌移植瘤生长的影响  39-41
  3 讨论  41-43
第二部分 RMP和HBX共同促进肝癌发生的分子机制  43-56
  1 材料与方法  44-48
    1.1 材料  44
    1.2 主要仪器设备  44-45
    1.3 实验方法  45-48
  2 实验结果  48-55
    2.1 人肝癌组织及对应癌旁组织RMP与HBx的表达量  48-50
    2.2 瞬时转染不同HBx剂量对HepG2细胞内源性RMP表达的影响  50-52
    2.3 RMP与HBx在细胞内的共定位  52-54
    2.4 RMP与HBx在细胞内的结合情况  54-55
  3 讨论  55-56
结论  56-57
参考文献  57-60
展望  60-61
综述：乙肝病毒X蛋白在肝癌发展中的作用  61-78
  参考文献  68-78
攻读硕士学位期间发表和待发表的论文  78-79
本论文受下列课题资助  79-80
缩略词表  80-82
致谢  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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