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槐果碱抗实验性小鼠肝癌作用及其机制研究

作　者: 张平平
导　师: 陈岳祥
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 槐果碱肝细胞癌诱导分化 CSCs
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

[研究背景及目的]肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)已经成为一个高度危险的疾病,其死亡率在全球癌症中排第五位。目前,治疗肝癌的有效方法,早期仍以传统的手术治疗为主,晚期多以放疗、化疗为主,但治疗效果并不确切,由于大部分病人不能耐受化疗过程的毒性反应,不能支付起昂贵的医药费,因此肝癌的治疗并未得到很大改善,故临床上迫切需要寻求一种新的治疗方法。肿瘤诱导分化治疗是近年肿瘤临床治疗方面的重要发现。所谓诱导分化是通过某些化学物质使不成熟的恶性细胞逆转,向正常细胞分化。肿瘤诱导分化的基本特点是不杀伤肿瘤细胞,而是诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常的细胞,临床上经典的治疗是维甲酸和砷剂诱导白血病细胞向正常成熟细胞发展,诱发白血病细胞凋亡,抑制肿瘤增长。而目前的研究证实人参、丹参酮等多种中药亦可使某些肿瘤细胞的一些恶性表型逆转和再分化,使得分化治疗恶性实体瘤也成为可能。槐果碱是从豆科槐属植物苦参及豆科槐属植物苦豆子中的干燥根及其地面部分提取的有效单体,是一种药源丰富,廉价、低毒且有效治疗各种炎症的药物,临床上槐果碱已用于治疗病毒性心肌炎,恶性葡萄胎和子宫内膜癌。但目前未见关于槐果碱治疗肝细胞癌的报道。本课题旨在观察槐果碱诱导分化治疗肝癌的作用,并初步探讨其可能的作用机制。[实验方法]一、槐果碱逆转人肝肿瘤细胞株恶性表型1.槐果碱对肝肿瘤细胞株中肝细胞相关功能基因表达影响将不同浓度的槐果碱(0,10,100pmol/L)处理24h后的人肝癌细胞株MHCC-97H和HCC-LM3进行real-time PCR检测细胞中一些肝细胞相关功能基因的表达情况。2.槐果碱对肝肿瘤细胞株中肝细胞相关功能基因表达的影响将不同浓度的槐果碱(0,10,100μmol/L)处理24h后的MHCC-97H、HCC-LM3肿瘤细胞进行real-time PCR检测肿瘤细胞株中干细胞相关功能基因的表达情况。3.槐果碱对肝肿瘤细胞成球能力的影响将不同浓度的槐果碱(0,1μmol/L)分别处理24h后的MHCC-97H的成球细胞进行real-time PCR检测肿瘤细胞株中肝细胞和干细胞相关功能基因的表达情况。二、槐果碱对人肝癌细胞株生物学功能的影响1.槐果碱对肝肿瘤细胞增殖和克隆形成能力影响将人肝癌细胞株LM3和MHCC-97H以5×103个/孔分入96孔板,分别用不同浓度的槐果碱(0,100,200,500,1000μmol/L)处理不同的人肝癌细胞株,从中筛选出两株敏感细胞株,然后分别于24,48,72h同一时间点检测细胞活性并绘制生长曲线图,并计算相关增殖抑制率。此外,将不同浓度的槐果碱(0,10,100,1000μmol/L)处理48h后的肝肿瘤细胞LM3和MHCC-97H各取3×103个/皿接种于6cm培养皿,连续培养2-3w。期间不停添加新鲜培液。同时将不同浓度槐果碱处理后的肝肿瘤细胞3×103个细胞接种于软琼脂糖胶上,连续培养2-3w。2.槐果碱对肝肿瘤细胞侵袭能力和迁移能力的影响将Matrigel包被Chamber上层,然后将不同浓度的槐果碱(0,10,100μmol/L)处理48h后的肝癌细胞LM3和MHCC-97H按每孔5×104细胞/200μl重悬于无血清的DMEM配液中,并接种到Chamber上层,下层24孔板中相应的加入600μl含10%FBS以及25μl的Fibronectin培养基,连续培养48h后,轻轻擦掉Chamber上层细胞,PBS稍微冲洗一下,然后0.5%结晶紫溶液染色,显微镜下观察拍照。同样我们将不同浓度的槐果碱(0,10,100μmol/L)分别处理24h后MHCC-97H、HCC-LM3肿瘤细胞消化后利用Transwell进行的细胞迁移实验,似上述侵袭能力检测实验,但不需Matrigel包被Chamber上层。三、槐果碱诱导分化治疗肝癌的机制1.槐果碱通过下调AKT/GSK-3β/β-catenin轴逆转肝癌细胞株的恶性表型Ras/MAPK, PI3K/AKT和Wnt/βcatenin通路在肿瘤细胞的发生发展中起重要的作用。我们将不同浓度的槐果碱(0,100,200,500,1000μmol/L)处理人的肝癌细胞株LM3和MHCC-97H24h后,用Western Blot检测上述通路相关蛋白的表达情况。结果显示PI3K/AKT通路的改变最为明显。我们接着检测下游AKT通路的下游蛋白p-GSK3β, GSK3β的变化,结果显示p-GSK3β蛋白可被明显抑制。研究发现AKT的磷酸化可明显抑制GSK-3β,而GSK3β与多种基因密切相关,当p-GSK3β活性被抑制后,GSK3β活性明显增加,β-catenin活性将被抑制。Wnt/β-catenin是维持肿瘤干细胞自我更新最重要的通路,β-catenin是Wnt/β-catenin重要的基因,当β-catenin活化后,肿瘤干细胞自我更新能力增强。我们前面的研究结果证实槐果碱能订效的抑制β-catenin的mRNA的表达。为进一步验证GSK3β和β-catenin的关系,我们用PI3K的激活剂IGF激活p-GSK3β的活性后,Western Blot检测p-GSK3β和相应β-catenin的变化。同样,我们用PI3K的抑制剂LY294002抑制p-GSK3β的活性后,Western Blot检测p-GSK3β的改变和棚应β-catenin的变化。2.槐果碱能下调TGF-β介导的EMTTGF-β在肿瘤细胞发生的EMT中起重要的作用,为进一步验证槐果碱抑制肿瘤细胞的转移是通过抑制TGFβ介导的EMT,我们将TGF-β与槐果碱共同处理24,48h的人肝癌细胞株进行Real-time PCR和Western Blot检测棚关表皮及间皮棚关指标。四、槐果碱治疗实验性小鼠肝癌1.槐果碱瘤内注射治疗肝癌皮下种值瘤将HCC-LM3以2×106/只注射至雄性nude小鼠腋下两侧,待肿瘤长出后的第6天,取左右肿瘤对称的小鼠入组,分别瘤内注射槐果碱和生理盐水,隔天1次注射,兆3w,观察皮下肿瘤生长情况,肿瘤生长体积=1/2×长×宽2。2.槐果碱腹腔注射治疗肝脏原位种植瘤将雄性4w Balb/c Nude小鼠麻醉后,从腹部正中切口后使其充分暴露肝脏,将2×106/只的HCC-LM3细胞接种至肝包膜下,10d后待肿瘤生长后,随机将小鼠分成两组,分别腹腔注射35mg/kg的槐果碱和生理盐水,每周5次,持续4w,4w后处死小鼠取出肝脏观察肿瘤大小。五、统计学处理数据采用SPSS16.0统计软件包进行分析。方差齐性两样本资料采用两样本双尾T检验；方差不齐的配对资料采用Wilcoxon符号秩检验；方差不齐的不配对资料采用Mann-Whitney U检验；P<0.05为具有统计学差异。[实验结果]一、槐果碱可诱导肝肿瘤细胞向肝细胞分化1.槐果碱下调肝肿瘤细胞株中CSCs比例我们发现小剂量的槐果碱(0,10,100μmol/L)可明显抑制HCC-LM3和MHCC-97H细胞中CD133、CD90、Epcam、AFP mRNA的表达水平,此外,槐果碱可降低与维护干细胞增殖和自我更新相关基因的表达,包括括β-catenin, Oct3/4, NANOG, c-Myc等。2.槐果碱可上调肝肿瘤细胞中部分肝功能相关基因表达将小剂量的槐果碱(0,10,100μmol/L)处理的人肝肿瘤细胞,利用real-time PCR检测后发现,槐果碱可明显上调部分肝功能基因表达,包括白蛋白(albumin, ALB)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G-6-P)、醛缩酶B (Aldolase B, ALDOB)、胆绿素还原酶(biliverdin reductase, BR)、细胞色素氧化酶P4501A3(cytochrome P4501a3,CYP1a3)等。二、槐果碱能抑制肝肿瘤细胞增殖及侵袭迁移能力1.槐果碱可抑制肝肿瘤细胞增殖及克隆形成我们发现当槐果碱浓度达到1000μmol/L,处理72h的人肝癌细胞株HCC-LM3、MHCC-97H的生长抑制率分别约为67.1%±2.12%和52.98%±3.44%,且其生长抑制作用呈明显剂量依赖性。我们还发现不同浓度的槐果碱均可明显抑制肿瘤细胞体外平板克隆及软琼脂克隆形成能力,且呈明显的剂量依赖(p<0.05, Student’s test)。同时我们用正常人肝细胞做对照时,发现高剂量的槐果碱(1000μmol/L)未抑制正常人肝细胞的增殖及克隆形成,所以我们认为槐果碱对正常人肝细胞没有毒性作用。流式细胞仪结果显示槐果碱能将人肝癌细胞株的细胞周期阻滞在G0/G1期,比例分别为20%±0.59%和19%±1.19%(p<0.05, Student’s test)。同时我们利用Real-time PCR和Western blot检测细胞周期蛋白cyclinD1的表达,结果发现槐果碱可明显抑制cyclinD1基因和蛋白的表达,同时上调P27基因的表达。2.槐果碱可抑制肝肿瘤细胞的侵袭和迁移细胞迁移实验结果说明在不抑制细胞增殖的情况下,槐果碱可明显降低肝癌细胞在体外的迁移能力,基底膜侵袭实验结果证明槐果碱能使人肝癌细胞株HCC-LM3、MHCC-97H细胞体外侵袭能力降低(p<0.05)。三、槐果碱诱导分化治疗肝癌的机制1.槐果碱通过下调AKT/GSK-3β/β-catenin轴逆转肝癌细胞恶性表型Ras/MAPK, PI3K/AKT和Wnt/βcatanin通路在肿瘤细胞的发生发展中起重要的作用。我们将槐果碱(0,100,200,500,1000μmol/L)处理人肝癌细胞MHCC-97H和LM324h后,Western Blot检测上述通路相关蛋白的表达情况。结果显示PI3K/AKT通路改变最为明显。我们接着检测下游p-GSK3β, GSK3β蛋白的变化,结果显示p-GSK3β被明显抑制。GSK3β与多种基因关系密切,研究发现p-GSK3β活性被抑制后,GSK3β活性明显增加,β-catenin活性被抑制,我们发现P-catenin的活性亦被明显的抑制。Wnt/β-catenin是维持肿瘤干细胞自我更新最重要的通路,β-catenin是Wnt/β-catenin通路的一个重要基因,当β-catenin失活后,CSCs自我更新能力减弱。我们前面的研究结果证实槐果碱能有效的抑制β-catenin的mRNA的表达。为进一步验证GSK3β和β-catenin的关系,我们用PI3K的激活剂IGF激活p-GSK3β的活性后,Western Blot检测p-GSK3β和相应β-catenin的变化。同样,我们用PI3K的抑制剂LY294002抑制p-GSK3β的活性后,Western Blot检测p-GSK3p的改变和相应P-catenin蛋白的变化。2.槐果碱能下调TGF-β介导的EMT我们将TGF-β与槐果碱共同处理24,48h的人肝癌细胞株进行real-time PCR和Western Blot检测,结果发现槐果碱能明显上调E-cad的表达,同时能下调Vitmentin, N-cad和β-catenin蛋白及基因的表达。四、槐果碱抑制实验性小鼠肝癌生长1.瘤内注射槐果碱抑制皮下种植瘤生长利用Blab/c Nude小鼠做皮下种植瘤形成后,瘤内注射35mg/kg的槐果碱可明显抑制肿瘤生长,大体照片显示肿瘤体积明显缩小,重量明显减轻,免疫组化结果显示槐果碱组Ki67阳性细胞比例减少。2.腹腔注射槐果碱抑制肝脏原位种植瘤形成利用Blab/c Nude小鼠做肝内原位种植瘤,待肝脏原位种植瘤形成后,腹腔注射槐果碱,每周5次,共4w。之后分别进行大体观察和HE染色,结果显示槐果碱组肿瘤较生理盐水组肿瘤明显缩小。[讨论]1.槐果碱可逆转肝肿瘤细胞株的恶性表型,促进肿瘤细胞向正常肝细胞表型分化。2.槐果碱可有效抑制肝肿瘤细胞的体外增殖和克隆形成能力,并抑制肝癌细胞株的侵袭和转移。3.槐果碱能通过下调AKT/GSK-3β/β-catenin轴的活性和TGF-β介导的EMT部分参与肿瘤细胞的诱导分化过程。4.槐果碱可有效治疗实验性小鼠肝癌,可能为以后临床治疗肝癌提供新的思路。

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