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全人源抗肝癌基因工程单链抗体与阿霉素偶联物的制备及其抗肿瘤作用研究

作 者: 陈琳
导 师: 李官成
学 校: 中南大学
专 业: 细胞生物学
关键词: 单链抗体 阿霉素 免疫偶联物 靶向药物 肝细胞癌
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


目的:构建全人源抗肝癌单链抗体原核表达载体,诱导表达获得有活性的单链抗体;利用葡聚糖为中介偶联单链抗体与化疗药物阿霉素以制备高效、小型化免疫偶联物;通过体内、外实验研究免疫偶联物的抗肿瘤效应,为肝癌的靶向生物治疗奠定基础。方法:采用PCR等方法构建pET-21a(+)-SA3原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),利用诱导剂IPTG诱导单链抗体ScFv-SA3的表达,蛋白提取及纯化,Western-blot验证ScFv-SA3蛋白大小,间接ELISA验证单链抗体ScFv-SA3的抗体活性,细胞免疫化学检测ScFv-SA3对人肝癌细胞系HepG2的特异性结合作用;以氧化葡聚糖Dextran-T10为中介偶联单链抗体ScFv-SA3与阿霉素(ADM),制备ADM-Dex-ScFv-SA3免疫偶联物,间接ELISA检测偶联物的抗体活性;MTT、平板克隆及裸鼠移植瘤模型等体内、外实验研究ADM-Dex-ScFv-SA3的抗肝癌作用。结果:成功构建pET-21a(+)-SA3重组载体,转化大肠杆菌原核表达体系后在IPTG诱导下表达可溶性单链抗体ScFv-SA3, SDS-PAGE验证蛋白大小为40KD;大量表达及纯化ScFv-SA3后,间接ELISA及细胞免疫化学检测到其具有抗体活性且对人肝癌细胞HepG2有特异性结合作用;以氧化Dextran-T10为中介介导ADM和ScFv-SA3形成稳定的免疫偶联物,其中ScFv-SA3:ADM摩尔比为1:14.21;体外实验MTT和平板克隆实验都显示偶联物ADM-Dex-ScFv-SA3对肝癌细胞生长抑制作用明显强于游离的ADM、ADM+ScFv-SA3,且对非靶细胞的毒性小于游离ADM;体内实验表明偶联物可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并能延长裸鼠的中位生存时间。总之,ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物显示了较强的抗肿瘤效应。结论:1.成功构建了原核表达载体pET-21a(+)-SA3,诱导表达后纯化获得有活性的全人源抗肝癌单链抗体ScFv-SA3。2.成功制备出以葡聚糖为中介的阿霉素和单链抗体免疫偶联物ADM-DEX-ScFv-SA3。3.免疫偶联药物ADM-Dex-ScFv-SA3在体外可明显抑制肝癌细胞的生长;在体内可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,且明显延长了裸鼠的中位生存时间。ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物显示了较强的抗肿瘤效应。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩写词简表  10-11
前言  11-17
技术路线  17-18
第一章 单链抗体ScFv-SA3的表达、纯化及鉴定  18-36
  第一节 材料与方法  18-27
    1. 材料  18-21
    2. 方法  21-27
  第二节 结果  27-34
    1. 重组质粒pET21a(+)-SA3的构建及鉴定  27-29
    2. ScFv-SA3蛋白诱导表达条件的摸索  29-31
    3. ScFv-SA3蛋白的纯化与鉴定  31-33
    4. ScFv-SA3蛋白活性鉴定  33-34
  第三节 讨论  34-36
第二章 单链抗体ScFv-SA3与阿霉素偶联物的制备  36-45
  第一节 材料和方法  36-40
    1. 材料  36
    2. 方法  36-40
  第二节 结果  40-43
    1. 单链抗体ScFv-SA3与阿霉素偶联物的制备  40
    2. 阿霉素的标准曲线及阿霉素浓度  40-41
    3. 偶联物中抗体蛋白的浓度  41-42
    4. 偶联物中阿霉素与抗体的摩尔比  42
    5. 偶联物中抗体活性检测  42-43
  第三节 讨论  43-45
第三章 ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物的抗肿瘤效应  45-54
  第一节 材料和方法  45-48
    1. 材料  45
    2. 方法  45-48
  第二节 结果  48-52
    1. 阿霉素单药以及偶联物对肝癌细胞HepG2的生长抑制作用  48-49
    2. 平板克隆形成实验  49-50
    3. 阿霉素单药以及偶联物在体内的抗肿瘤作用  50-52
  第三节 讨论  52-54
结论  54-55
参考文献  55-60
综述  60-69
  参考文献  66-69
硕士期间发表的论文  69-70
致谢  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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