学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

MiR-221增强干扰素抗HCV作用及atRA对肝癌细胞的血清饥饿保护作用研究

作　者: 许刚
导　师: 任浩
学　校: 第二军医大学
专　业: 微生物学
关键词: 丙型肝炎病毒 miR-221 细胞因子信号转导抑制因子干扰素肝癌维甲酸 COL8A2
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 11次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是导致输血后肝炎的主要病原体之一，其流行呈全球性分布，全世界有1.7～2亿人感染HCV。HCV导致的丙型肝炎易慢性化，慢性率高达70%，且与肝硬化以及肝细胞癌高度相关。目前HCV的治疗方法主要是干扰素-α（interferon-α，IFN-α）联合利巴韦林，但是疗效并不理想，且治疗昂贵、副作用大。肝癌是全球第五大流行的肿瘤，全球每年有超过50万新患者。HCV感染是诱发肝细胞癌的重要因素之一，具体的诱发机制尚未完全清楚。据报道，HCV基因组编码的多个蛋白如核心蛋白core、非结构蛋白NS5A等与肝癌发生有关。目前，对肝癌的治疗仍以手术切除为首选，同时辅以化学治疗或者药物治疗。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小分子RNA，主要生物学功能是通过与其靶标分子的3-UTRs结合来抑制翻译或降解mRNA来调控基因表达。miRNAs参与各种细胞发育、增殖、分化、凋亡等，并参与肝癌症等多种疾病的发生发展。研究表明，miRNAs作为一类新的分子靶标，应用于肿瘤的诊断、治疗及预后判断等。同时，由于肝癌的治疗效果局限，诱导分化作为一个新型而有效的肿瘤治疗方法用于肝癌的治疗，诱导分化剂也因此越来越受到关注。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是迄今为止发现的最重要的一类诱导分化剂，已成功应用于治疗急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL），但有研究表明atRA在一定条件下可以保护癌细胞。本文就miR-221对HCV的调控以及atRA保护肝癌细胞生存的作用机制进行了研究。一、MiR-221作用于SOCS1/SOCS3增强IFN抗HCV作用随着分子生物学技术的不断更新，研究人员采用RNA干扰、生物芯片等方式对HCV生命周期进行了深入研究，确定了与病毒入侵相关的四个受体分子（CD81、SR-BI、Claudin-1和Occludin），并发现了具有调节病毒复制作用的磷脂酰肌醇4激酶和作用于病毒包装释放过程中的脂蛋白等。最近研究发现microRNAs在病毒的生命周期中扮演者重要的角色。例如miR-122通过与HCV5，-UTR结合促进病毒的复制，miR-193b调节HCV对Sorafenib药物的敏感性等等。miR-221广泛表达在各种组织细胞中，其编码基因位于X染色体上，通过作用于CDKN1C/p57、CDKN1B/p27、Bmf等分子促进肝细胞癌的发生。本研究首先检测到HCV感染的细胞上清以及病人血清中的miR-221水平升高。在Huh-7.5.1细胞中转染miR-221的mimics与inhibitor后再以HCVcc（HCV cell culture-derived virus）感染，通过FQ-PCR和免疫荧光检测其对HCV感染性的影响。结果显示miR-221过表达或抑制对HCV的复制却没有影响。在Huh-7.5.1中加入IFN-α后，可以观察到miR-221显著增强干扰素的抗HCV作用。故推测miR-221抑制HCV的复制与干扰素相关。将miR-221mimics与inhibitor转染Huh-7.5.1细胞后以HCVcc感染，发现HCV感染可以促进IFN-α的表达，但却不受miR-221水平的影响。继而，通过western blot的方法检测miR-221对IFN-α/JAK/STAT信号转导途径的影响，过表达miR-221后，JAK1、STAT1与STAT3分子的磷酸化水平上升，inhibitor则有相反的作用。通过Targetscan与PicTar在线数据库预测没有发现JAK/STAT通路中的成员与miR-221有直接的相互作用，但发现细胞因子信号转导抑制因子（suppressors of cytokine signaling，SOCS）家族的SOCS1、SOCS3两个分子的3，-UTR存在miR-221的结合位点。为了证实上述预测，我们构建了表达荧光素酶报告基因的SOCS1和SOCS3野生型和突变型（miR-221不能与SOCS1、SOCS3发生相互作用）表达载体，与miR-221mimics共转染HEK-293T细胞，检测荧光素酶活性，实验结果表明SOCS1和SOCS3是miR-221的靶标分子。为了确认miR-221是通过SOCS抑制HCV的复制，我们随后构建了SiSOCS1、SiSOCS3小干扰RNA来分别干扰SOCS1、SOCS3的表达。结果表明下调SOCS后，JAK/STAT的信号转导增强，即JAK1、STAT1、STAT3的磷酸化水平升高，随即HCV的复制水平下降，干扰素的抗HCV作用增强。上述研究结果表明，SOCS家族是JAK/STAT通路的主要负调控因子，miR-221作用于SOCS后抑制其表达，继而减弱了SOCS对IFN/JAK/STAT的负调控作用，故推测miR-221是通过抑制SOCS1、SOCS3的表达而促进JAK/STAT信号转导进而抑制HCV的复制。病毒入侵宿主细胞并建立完整的感染周期是一个复杂的过程，不仅有宿主的抗病毒免疫应答，同时病毒也通过逃逸而复制播散，该过程是病毒与宿主相互博弈的过程。miR-221在HCV感染与复制中也发挥着不同的作用，一方面可以维持HCV基因组的稳定性并促进其复制，另一方面还可以通过作用于SOCS1/SOCS3增强IFN的抗HCV作用。基于病毒与宿主相互作用的复杂性，miR-221在HCV复制和感染中的作用有待进一步研究。二、全反式维甲酸保护肝癌细胞抵御血清饥饿作用维甲酸（RA）又称为视黄酸，是由维生素A在体内氧化成视黄醛，再进一步氧化而成。维甲酸可调节细胞的增殖、分化与成熟，是维持机体正常生长发育和各种生理活动必不可少的重要因素。维甲酸发挥生物活性主要是通过与细胞内的维甲酸受体RAR（retinoid-x receptor）结合，形成异二聚体结合到DNA上调节下游基因的表达。atRA（全反式维甲酸）是迄今为止发现的最重要的一类诱导分化剂。atRA用于肝细胞癌的治疗基于以下三个方面的作用：1.诱导癌细胞凋亡；2.抑制肿瘤细胞增殖；3.诱导肝癌细胞分化。atRA用于肝细胞癌的治疗时因条件变化而具有不同表现，正常的条件下具有抑制肿瘤细胞生长，诱导分化促进凋亡的效果，但在血清饥饿的时候，atRA却保护肝癌细胞，表现为相反的效果。本研究对atRA保护肝癌细胞抵抗血清饥饿的可能机制进行了研究。我们对三种肝癌细胞系（HepG2、HepG3B和Huh7细胞）进行无血清、无血清和atRA共培养，观察细胞的生长。结果表明HepG2细胞在血清饥饿36小时后开始凋亡，48小时后细胞凋亡超过50%，96小时后细胞几乎全部死亡；但经10μMatRA处理后的HepG2细胞在血清饥饿下到60小时才开始凋亡，120小时后细胞还保持有30%存活，168小时后细胞才全部死亡。在Hep3B和Huh-7细胞中得到类似的结果。这说明atRA在无血清条件下具有保护肝癌细胞的作用，且这种保护作用具有剂量依赖性。为了探索atRA的保护机制，我们用流式细胞术检测对照组以及实验组的细胞周期和细胞凋亡：atRA处理的细胞与对照细胞在细胞周期和细胞凋亡上没有显著差别。我们在培养细胞时意外发现atRA处理组细胞较对照组细胞贴壁早，进一步设置不同检测时间点，发现atRA处理可以明显增强细胞的粘附作用。细胞的粘附能力一般是受细胞外基质分子影响的，用Illumina Human HT-12v4芯片检测atRA处理组与对照组的基因表达时发现：有380个基因表达差异，其中207个上调，173个下调。上调倍数最高的基因是CYP26A1、HINT3、miR-1282、CYP26B1。对基因差异进行功能分析发现与细胞外基质相关的基因主要分布在上调区，其中变异较大的是COL8A2（collagen8A2）分子。通过RT-PCR与Western blot进一步确认了该结果。这提示COL8A2可能参与到了atRA对肝癌细胞的血清饥饿保护作用。为了确认该推测，随后用siRNA下调COL8A2的表达，发现atRA对COL8A2下调的肝癌细胞的血清饥饿保护作用也消失了，同时对细胞的粘附增强作用也消失了。进一步研究表明，COL8A2除了具有增强细胞粘附的能力之外，还具有增强肝癌细胞迁移与侵入的能力：COL8A2过表达后，肝癌细胞的迁徙率和侵染率分别增加了31.6%和77.8%，而干扰COL8A2的表达，细胞迁徙率和侵染率分别降低了32.2%和59.6%。综上所述，血清饥饿的条件下atRA能保护肝癌细胞免受凋亡作用，该作用是通过上调COL8A2表达而实现的。肿瘤的诱导分化治疗是一个新颖的治疗方法，目前对其研究还处在初步的阶段，还存在很多的未知领域。有效的诱导分化剂是该方案的关键，atRA是目前发现的最有效诱导分化剂，但也有一些负作用的报道。我们的研究进一步丰富了atRA在抗肝癌治疗中的不同角色，为其用于临床治疗肝癌提供基础研究数据。小结：1. MiR-221能够抑制HCV复制，该抑制效果通过抑制SOCS1/SOCS3的表达，促进JAK/STAT信号转导，从而增强了干扰素的抗病毒效果而实现的。2.全反式维甲酸在肝癌细胞无血清培养时能够保护肝癌细胞，该作用是通过上调COL8A2的表达进而增强了肝癌细胞的粘附、迁徙和侵染而实现。3.上述研究探讨了miRNAs在HCV生命周期中的作用以及新型肝癌治疗药物atRA在治疗中的双重作用，为临床肝炎和肝癌的治疗奠定了基础。

MiR-221增强干扰素抗HCV作用及atRA对肝癌细胞的血清饥饿保护作用研究

内容摘要

全文目录

相似论文