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Hes1基因与原发性肝癌发生相关性的体内外实验研究

作　者: 冯娜
导　师: 朱海英
学　校: 第二军医大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 原发性肝癌 Notch信号通路 Hes1基因
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


原发性肝癌（Primary Hepatocellular Carcinoma, PHC）是全世界最常见的肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因。它具有发病隐匿、恶性病变快、恶性程度高、死亡率高和术后早期复发率高等特点。超过80%的原发性肝癌死亡病例发生在发展中国家。在中国，肝癌是第二大癌症致死疾病。因此，肝癌的防治工作任重道远。目前，其确切的病因和发病机制尚未完全清楚。只有对肝癌发生发展的机制进行深入研究，才能有效的防治肝癌。Notch信号通路是在进化过程中高度保守的一条信号通路，广泛地存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中，Notch信号通路是介导细胞之间直接接触的主要信号通路之一，主要参与调控多细胞机体的增殖、凋亡和分化。现已发现Notch受体和信号通路在人类某些癌症中异常表达，如结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、宫颈癌、肾癌和一些淋巴系统的肿瘤等。因此，Notch信号通路被认为可以是潜在的肿瘤治疗靶点。当前研究表明，Hes1(hairy enhancer of split1)基因的表达受到跨膜蛋白Notch的调控，该调控过程被称为Notch-hes1信号通路。Notch与相邻细胞表面的配体结合后被激活，其胞内亚基NICD（the intracellular domain of Notch)从细胞膜上脱离，然后通过自身的核定位信号进入细胞核。在细胞核中，NICD与DNA结合蛋白RBP-J相结合，形成转录激活因子。该因子结合到Hes1的启动子上，诱导其表达。现有的一些实验数据表明，Hes1基因对于人体各种细胞前体细胞未分化状态的维持，起着非常重要的作用。也有研究表明，它可以使未分化细胞的数量维持在相对稳定的水平。同时，它还具有促进细胞分化方向、决定细胞命运选择的重要作用。近年来的研究发现，Hes1基因对于干细胞自我更新能力的维持也有重要作用，它可以抑制干细胞不对称的有丝分裂。另外，研究也发现在某些肿瘤，包括横纹肌肉瘤、骨骼肌肉瘤、胶质瘤中，Hes1基因呈现异常表达，提示Hes1基因与肿瘤的发生和发展存在相关性。本研究的目的就在于揭示Hes1的表达与原发性肝癌发生之间的相关性。采用RT-PCR和Western blot的方法，我们分别在RNA水平和蛋白水平检测了小鼠肝癌细胞系Hep1-6、H22中Hes1的表达情况，发现Hes1基因在小鼠肝癌细胞中呈现出显著高表达的特点。提示Hes1基因的高表达可能与原发性肝癌的发生存在相关性。因此，本研究首先通过构建Hes1基因的shRNA慢病毒载体，筛选获得Hes1基因稳定沉默的肝癌细胞系Hep1-6-sh-Hes1。通过比较基因沉默前后肝癌细胞系在体外增殖特性以及体内成瘤能力等生物学特性的变化，揭示Hes1与原发性肝癌发生的密切关系。通过细胞增殖曲线、克隆形成能力以及细胞增殖相关指标的测定，我们发现Hes1基因沉默后，肝癌细胞株Hep1-6的增殖受到明显抑制。细胞划痕实验结果显示，Hes1基因沉默后，肝癌细胞的侵袭能力降低。通过PI染色，我们观察了Hes1沉默的Hep1-6肝癌细胞的凋亡和细胞周期进程。结果表明Hes1沉默的肝癌细胞出现细胞周期G1期的阻滞，而且细胞周期相关蛋白的表达了也发生相应的变化，如CDK2, CDK4和CDK6的表达降低，p21和p53的表达升高。这些结果提示在某种程度上，沉默Hes1的表达可以通过调控细胞周期相关基因的表达来抑制肝癌细胞的生长。另外，荷瘤实验表明，Hes1沉默的Hep1-6细胞在NOD/SCID小鼠体内的成瘤能力明显降低，提示Hes1的表达升高可能是体内肿瘤发生的必要因素之一。这些研究结果提示了Hes1与肝癌发生的密切关系。为了进一步证实这种相关性，我们对5例人原发性肝癌的临床样本进行分析，发现Hes1基因在原发性肝癌中呈现出高表达的特性，与上述小鼠相关的体内外研究结果具有一致性，这为进一步深入研究Hes1基因在肝癌发生中的作用机制，为原发性肝癌的新的诊断和治疗方法的建立提供了实验依据。本研究首次发现了原发性肝癌中Hes1基因呈现高表达的特征，并通过RNA干扰Hes1基因的表达，成功建立了Hes1基因稳定沉默的细胞株，它可以作为研究Notch-Hes1信号通路及其与原发性肝癌关系的细胞模型。本研究初步探讨了Hes1基因沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响，揭示了Hes1基因与肝癌发生的相关性。然而，Hes1基因的作用机制尚待进一步研究，希望在更深入的研究之后能够为原发性肝癌的治疗和诊断提供新的方法和思路。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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