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MicroRNA-494抑制肝癌细胞增殖与迁移能力的研究

作　者: 杨生生
导　师: 焦炳华
学　校: 第二军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝癌 microRNA miR-494 增殖迁移
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一。目前,其发病率在世界范围内呈上升趋势,在全球恶性肿瘤发病率中占第5位,每年新增肝癌患者约56万,其中超过50%的病例发生在我国。肝细胞癌具有发病隐匿,早期诊断困难,恶性程度高,进展快,预后差,侵袭性强的特点,其病死率极高。在全球范围内,仅次于肺癌、胃癌,居恶性肿瘤死因的第3位,其五年生存率只有不到5%。因此,对肝癌发生发展及其转移复发的分子机制的进行研究,寻求肝癌有效的治疗方法和预防转移、复发的措施,对提高肝癌的治疗效果和预后具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是近年来在真核生物中发现的起转录后调控作用的一种大小约21-23个碱基的非编码单链小分子RNA。编码miRNA的基因多位于基因间或编码基因的内含子区域,以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在。成熟miRNA主要通过其5’端2-8nt的种子序列(seed sequence)与位于靶基因mRNA3’UTR的miRNA调控元件(miRNA regulatory element, MRE)的不完全碱基配对,相互识别,并通过抑制蛋白质翻译和引发mRNA降解这两种机制实现对靶基因表达的转录后调控。目前认为miRNA直接调控基因组中三分之一以上基因的表达,在干细胞维持、细胞分化、增殖、凋亡、代谢、胚胎发育以及免疫应答等生命活动中发挥重要作用。同时,大量证据表明,miRNA的表达异常与包括癌症、心血管疾病、病毒感染在内的多种疾病的发生发展有密切关系。研究显示miRNA在多种肿瘤中的表达水平发生了变化,如在肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病等恶性肿瘤中。这些miRNA可通过调节相应癌基因和抑癌基因的表达,发挥抑癌或促癌作用,在肿瘤发生发展中所发挥了重要作用。此外不同表达模式的miRNA还与肿瘤的分型分级以及预后密切相关,其表达的模式可作为肿瘤诊断和判断预后的分子标记。因此,研究与肝癌发生发展相关的miRNA表达的变化,探索肝癌发生发展的分子机制,这对肝癌的早期诊断和及时防治具有非常重要的意义。肝脏再生和肝脏肿瘤都表现为肝脏细胞极强的增殖能力,肝癌的发生发展和肝再生过程中肝细胞的增殖存在内在联系。在肝再生过程中,对肝细胞增殖发挥正、负调控信号作用的分子,同样可能对肝癌的发生发展起到一定的作用。一些研究已经表明,一些miRNAs在肝再生过程中表达发生改变,通过调节相庆靶基因的表达,从而影响肝细胞增殖,而这些miRNAs也对肝癌细胞的增殖同样有类似作用。我们的小鼠肝再生早期的niRNAs芯片数据显示miR-494在肝再生早期表达下调,同时也有研究表明,miR-494对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。由此我们设想肝癌的发生可能和miR-494的表达下调有关,miR-494可能通过调控靶基因的表达参与肝癌的发生发展,恢复miR-494的表达可能会抑制肝癌的生长。因此我们对miR-494与肝细胞癌之间的关系进行研究。本研究首先在不同肝癌细胞系、肝癌及相应癌旁组织中检测miR-494的表达差异,研究其与肝癌临床病理特征之间的关系：通过体外和体内实验,检测了miR-494对肝癌细胞Huh7增殖和迁移能力的影响；利用Realtime PCR、Western Blot和萤光酶报告基因检测对预测的靶基因进行了鉴定；利用siRNA技术对miR-494靶基因ROCK1的功能进行了验证。内容主要分为以下3个部分。第一部分microRNA-494在肝癌细胞株和肝癌标本中的表达为了确miR-494在肝癌中的表达情况,明确miR-494与肝癌之间的关系,我们利用Realtime PCR检测了不同肝癌细胞系和34例临床肝癌标木中miR-494的表达水平,并对miR-494表达水平和肝癌临床病理特征之间的关系进行了统计分析。结果发现,与正常肝细胞L02相比,miR-494在肝癌细胞Huh7、HepG2和Hep3B中表达明显下调(差异在2倍以上)：约70%(24/34)的肝癌病例中,肝癌组织内miR-494的表达水平比对应的癌旁组织下调,其表达水平的下调可能与肝癌的大小的临床病理特征有关(P<0.05),而与其他临床病理特征无关。结果表明miR-494可能通过调控靶基因的表达参与肝癌的发生发展。第二部分miR-494在肝癌细胞Huh7中的生物学功能为阐明miR-494在肝癌中的作用机制,明确miR-494对肝癌细胞的生物学功能,我们利用miR-494模拟物(mimic)转染Huh7细胞,通过MTT、克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验及裸鼠移植瘤实验等检测其对Huh7细胞功能的影响。MTT和克隆形成实验结果发现,与对照组相比,Huh7细胞转染miR-494mimics后,其增殖能力明显减弱,流式细胞术检测发现,miR-494能引起Huh7细胞发生细胞周期G1期阻滞,但对其细胞凋亡无明显影响；细胞划痕实验结果发现,miR-494能抑制Huh7细胞的迁移能力；将转染miR-494mimcs的Huh7细胞种植于BALB/c裸鼠体内,发现与对照组相比,移植瘤生长受到明显抑制,Ki67免疫组化染色结果显示,细胞增殖明显减弱。本部分结果表明miR-494可通过引起Huh7细胞发生G1期细胞周期阻滞,从而抑制其增殖,同时miR-494具有抑制Huh7细胞迁移的功能,提示miR-494可能对HCC的发生发展起重要作用。第三部分miR-494靶基因的预测和鉴定为进一步探索miR-494抑制Huh7细胞增殖和迁移的分子机制,我们对miR-494的靶基因进行了鉴定。我们首先利用生物信息学方法预测miR-494的可能靶基因,并对这些靶基因进行功能分类,筛选出与影响细胞增殖和迁移的靶基因,结合文献及realtime PCR检测转染miR-494mimics后靶基因的变化初步明确了CDK6(cyclin-dependent kinase6)和ROCK1(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase1)为miR-494的靶基因；通过构建CDK6和ROCK1的野生型3’UTR和突变型3’UTR的报告基因质粒,利用双萤光素酶报告基因检测系统,验证了miR-494确实能直接作用于CDK6和ROCK1的3’UTR,抑制其表达。我们还利用siRNA技术证实抑制CDK6和ROCK1的表达,能明显抑制Huh7细胞的增殖和迁移能力。结果表明,CDK6和ROCK1是miR-494的直接靶基因,miR-494可能通过调节它们的表达来发挥其抑制Huh7细胞增殖和迁移的作用。本研究表明,miR-494可能作为肝细胞增殖的负性调节分子,其表达下调参与肝癌的发生发展过程,同时miR-494可靶向抑制ROCK1的表达,其表达下调可能有助于肝癌转移。miR-494可作为HCC的分子标志物,并为新型肿瘤治疗药物的开发提供新的分子靶点。

MicroRNA-494抑制肝癌细胞增殖与迁移能力的研究

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