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肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织HBVcccDNA的原位检测

作 者: 胡双烨
导 师: 钟彦伟
学 校: 桂林医学院
专 业: 病理学与病理生理学
关键词: 乙型肝炎病毒 共价闭合环状DNA 肝细胞癌 原位PCR 滚环扩增
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 21次
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内容摘要


目的:原发性肝细胞癌(HCC)是一种常见的高度恶性肿瘤,其发病率位居我国癌症发病率的第二位。流行病学证实乙肝病毒(HBV)的感染是HCC发生的独立危险因素。共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV生命周期中重要的复制中间体,是乙型肝炎病毒前基因组RNA(pgRNA)的原始合成模板,已经被公认为HBV持续感染和肝脏进行性病理改变的根本原因。体外试验及动物试验研究均提示HBVcccDNA与肝细胞癌变的发生密切相关。目前,肝组织内HBVcccDNA的定量检测方法随着PCR技术的发展和应用已日趋成熟,而人肝癌组织内HBVcccDNA的定位检测研究,国内外鲜见报道。本研究通过一种新型的原位检测方法,检测HCC患者癌及癌旁组织中HBVcccDNA的表达,探讨其在HCC中的意义,为临床上原发性肝细胞癌的预防和治疗提供新的理论根据。方法:收集20例北京302医院2011年9月-2012年9月期间住院的HCC患者癌及癌旁组织手术切除标本,经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,5μm连续切片后使用。采用不降解质粒的ATP依赖的DNA (PSAD)酶消除松弛的环状HBVDNA(rcDNA)后,根据我国常见的HBV基因型B、C基因组全序列,设计引物4对,应用原位滚环扩增(RCA)的方法只扩增环状的DNA,再采用针对HBVcccDNA与HBVrcDNA结构上的差异所设计的5端地高辛标记的特异性引物进行直接原位跨缺口PCR,进一步扩增HBVcccDNA。通过免疫组织化学方法进行显色,在显微镜下观察HBVcccDNA在肝组织中表达及分布。以肝癌患者肝组织为例,设置无引物、无地高辛标记引物、无Phi29酶和DNA聚合酶反应体系,以及非乙型肝炎病毒感染肝组织(包括健康成人肝组织5例,转基因小鼠肝组织2例,丙型肝炎患者肝组织3例)作为阴性对照组。结果:20例肝细胞癌患者肝组织标本中有17例(85%)检测到HBVcccDNA阳性信号,为紫红色或紫蓝色呈团块状,定位于细胞核。肝癌患者癌组织及癌旁组织HBVcccDNA阳性率分别为10%(2/20)和85%(17/20),两者差异有显著性(P<0.01)。阴性对照组均未见阳性信号表达。结论:PSAD酶消化加滚环扩增结合原位PCR方法能够定位检测肝癌组织和癌旁组织中HBV cccDNA的表达,该方法具有一定的特异性和敏感性;肝细胞癌患者癌旁组织病毒复制水平高于癌组织。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
英汉缩略词对照表  8-9
前言  9-12
1 材料与方法  12-19
2 结果  19-26
3 讨论  26-30
4 结论  30-31
参考文献  31-36
综述  36-62
  参考文献  53-62
攻读学位期间发表的学术论文目录  62-63
致谢  63-65
桂林医学院硕士研究生学位论文答辩资格审查表  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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