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IGF2基因组印迹介导结直肠癌的靶向治疗作用的实验研究

作　者: 聂珍琳
导　师: 王书奎
学　校: 南京医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 基因印迹重组腺病毒 IGF2 结直肠癌靶向治疗
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：构建携带胰岛素样生长因子2印迹系统(IGF2imprinting)的重组腺病毒,探讨其用于结直肠癌靶向治疗的可行性。方法：1.采用聚合酶链反应(PCR)扩增人源的IGF2imprinting系统启动子H19、增强子enhancer及甲基化区域CTCF,并克隆至穿梭质粒pDC-315中,构建IGF2imprinting系统；2.从质粒pEGFP-C1vector和TOPK中分别扩增出EGFP和E1A片段,插入到构建好的IGF2imprinting系统重组质粒中,构建成重组腺病毒穿梭质粒；3.经感受态菌TOP10扩增、纯化,并分别与腺病毒骨架pBHGloxΔE1,3Cre通过脂质体Lipofectamine2000介导共转染HEK293细胞,产生两种有感染能力的腺病毒Ad-H19-CTCF-enhancer-EGFP和Ad-H19-CTCF-enhancer-E1A,分别命名为Ad315-EGFP和Ad315-E1A;4. Ad315-EGFP分别感染正常IGF2印迹(MOI)细胞GES-1和HCT-116以及IGF2印迹丢失(LOI)结直肠癌细胞HCT-8和HT-29,荧光显微镜下观察各组细胞中EGFP的表达；5.运用已上市溶瘤腺病毒药物H101作为阳性对照,验证重组腺病毒载体的选择性和抗肿瘤效应。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测分别用Ad315-E1A和H101感染后各组细胞中E1A基因和蛋白的表达；采用MTT法和流式细胞术检测Ad315-E1A体外抗肿瘤效应；6.构建皮下移植瘤裸鼠模型,研究Ad315-E1A在体内的抑瘤作用。结果：1.感染腺病毒载体的HEK293细胞表达EGFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的腺病毒滴度为1×1010pfu/ml;2.所构建重组腺病毒Ad315-EGFP感染各组细胞后,EGFP蛋白仅在IGF2LOI细胞HCT-8和HT-29中表达；3.各组细胞经Ad315-E1A感染后,E1A基因和蛋白仅在LOI细胞HCT-8和HT-29中表达；且HCT-8细胞经Ad315-E1A10pfu/cell感染72h后,其增殖活力降低至(53.4零6.4)%,凋亡率升高至(23.9±3.7)%；经H101感染的各组细胞中,E1A基因和蛋白仅在p53突变的细胞HT-29中表达；4.多点注射Ad315-E1A治疗HCT-8移植瘤,结果显示Ad315-E1A(?)能够有效抑制移植瘤的生长,抑瘤率达32.1%。结论：1.成功构建了携带IGF2印迹系统和E1A基因的重组腺病毒；2.重组腺病毒Ad315-E1A能够有效杀伤IGF2LOI结直肠癌细胞；3.为依赖IGF2LOI的肿瘤靶向治疗开拓了新的途径

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中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-13
第一部分 IGF2基因组印迹介导肿瘤靶向治疗在体外水平的研究  13-40
  1 材料  13-19
  2 实验方法  19-30
  3 结果  30-37
  4 讨论  37-40
第二部分 IGF2基因组印迹介导肿瘤靶向治疗在体内水平的研究  40-52
  5 材料  40-42
  6 方法  42-46
  7 结果  46-50
  8 讨论  50-52
结论  52-53
参考文献  53-57
文献综述  57-67
  参考文献  62-67
附录  67-68
在读期间发表的学术论文及研究成果  68-69
致谢  69

IGF2基因组印迹介导结直肠癌的靶向治疗作用的实验研究

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