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结直肠癌中MAP4K4基因功能的初步研究

作 者: 于倩
导 师: 杨磊
学 校: 南方医科大学
专 业: 病理学与病理生理学
关键词: 免疫组化 MAP4K4 结直肠癌 侵袭 转移
分类号: R735.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


研究背景和目的大肠癌是常见的恶性肿瘤之一,近十年来,在我国结直肠癌的发病率逐年增加。转移是影响患者治疗效果和死亡的重要原因,是结直肠癌术后复发的直接原因。因此,探讨与结直肠癌转移相关的因素及其分子机制,寻找预防和治疗的有效途径,是结直肠癌研究的重要内容。MAP4K4全名mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase4,即丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4。人MAP4K4定位于2q11.2,全长7183bp,含有33个外显子,编码1239个氨基酸。MAP4K4属于GCK激酶的一个成员,GCK激酶是由哺乳动物STE20/MAPK4家族催化区的相关的28种丝氨酸/苏氨酸激酶组成。目前研究发现MAP4K4有调节多种重要的细胞生理过程和信号传导途径的作用,包括在细胞内与ATP、核苷酸等的结合、多种蛋白质的活化、小GTP调节剂活化、细胞运动性、细胞骨架重排以及细胞增殖等。MAP4K4与卵巢癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤以及前列腺癌等疾病相关,在卵巢癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌中促进肿瘤的侵袭、转移和发展,并影响肿瘤预后,结直肠癌中未见报道。本研究通过重点探讨MAP4K4基因对结直肠癌侵袭、转移及增殖的影响和作用机制,来阐明MAP4K4基因在结直肠癌转移中的主要生物学功能,为结直肠癌的临床诊治、药物筛选及预后判断奠定理论基础。研究方法1.结直肠癌组织中MAP4K4的表达及临床意义应用免疫组化S-P法,检测220例有7年随防资料的结直肠癌病例中MAP4K4的表达,分析MAP4K4的表达与结直肠癌各临床因素的关系,用Kaplan-Meier和Cox回归分析法进行生存分析。2. MAP4K4基因沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响采用荧光定量PCR方法检测MAP4K4基因在六种结直肠癌细胞株(SW480、SW620、LS174T、LOVO、HT29和HCT116)中mRNA的表达,筛选MAP4K4表达较高的细胞株;设计并挑选有效地MAP4K4基因干扰片段,进行慢病毒包装,并将其导入内源性表达MAP4K4基因较高的人结直肠癌LS174T、SW620两种细胞株中,细胞流式分选稳定细胞株;观察MAP4K4基因干扰前后,体外侵袭、细胞增殖的变化。3. MAP4K4基因参与结直肠癌相关信号通路的初步研究通过Western blot检测LS174T、SW620结直肠癌细胞株中MAP4K4沉默后,MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路中p-ERK、t-ERK、p-AKT、t-AKT在蛋白水平的表达变化。研究结果:1.结直肠癌组织中MAP4K4的表达及临床意义1.1MAP4K4与结直肠癌各临床因素之间的关系在220例结直肠癌组织中MAP4K4的高低表达率分别为42.7%(n=94),57.3%(n=126),结果显示结直肠癌的性别,年龄,组织类型,分化程度及浸润深度与MAP4K4在结直肠癌组织中的表达没有关系;而无淋巴结转移的结直肠癌中MAP4K4的表达显著低于有淋巴结转移的结直肠癌(z=-2.689,P=0.011)。1.2MAP4K4对结直肠癌患者术后生存时间的影响为了确定MAP4K4表达与结直肠癌患者预后的关系,采用Kaplan-Meier法描述生存曲线及Log-rank法检验其统计学意义。在随访期内病例最短有效随访时间为七年,结果显示在随访期内MAP4K4低表达组3年、5年、7年累积生存率分别为70.6±4.1(%)、61.9±4.3(%)、57.6±4.4(%);高表达组3年、5年、7年累积生存率分别为61.7±5.0(%)、45.7±5.1(%)、34.4±5.3(%);低表达组平均生存时间为90.668±5.246(月),高表达组平均生存时间为72.148±5.890(月)。其差异经Log-rank检验其差异有统计学意义(x2=6.169,P=0.013)。1.3其他各临床因素对结直肠癌术后生存时间的影响其他各临床因素中淋巴结转移情况对患者术后生存时间有显著性影响,无淋巴结转移组3年、5年、7年累计生存率为72.9±3.9(%)、62.0±4.3(%)、57.8±4.5(%),术后平均生存时间为98.214±4.792(月);有淋巴结转移组3年、5年、7年累计生存率为47.3±5.2(%)、40.7±5.1(%)、37.1±5.1(%),术后平均生存时间为61.279±6.185(月);其差异经Log-rank检验有统计学意义(x2=19.473,P=0.000)。而患者的性别,年龄,组织分化,浸润深度以及病理类型对术后生存时间无显著性影响。1.4影响生存期的Cox模型多因素分析经单因素分析结果显示淋巴结的转移及MAP4K4的表达对患者的预后有显著影响,将这两个因素经多因素Cox分析(表1-4)发现淋巴结的转移以及MAP4K4的高表达显著增加患者的死亡风险(B=0.763,P=0.000; B=0.379, P=0.045)(表1-4)。Cox模型检验结果说明MAP4K4的高表达及淋巴结的转移可以作为患者预后的独立危险因素。2.通过RNAi技术沉默结直肠癌细胞株MAP4K4表达,建立MAP4K4基因稳定沉默的结直肠癌细胞株2.1验证基因芯片结果在前期试验中我们在结直肠癌细胞SW480以及其亚系SW480-SCP51, SW480-SCP58中应用全基因组表达谱芯片筛选出差异显著性基因MAP4K4。本实验采用荧光定量PCR检测这三株细胞中MAP4K4基因mRNA的表达,结果显示在这三株细胞中SW480-SCP58中MAP4K4的表达显著低于SW480以及SW480-SCP51中的表达,经单因素方差分析以及LSD法两两比较显示其差异具有统计学意义(P<0.05)。荧光定量检测结果与前期基因芯片检测结果一致。2.2结直肠癌细胞株中MAP4K4基因的表达应用荧光定量PCR, Western blot.细胞免疫组化检测6种结直肠癌细胞株中MAP4K4基因的表达,其结果经单因素方差分析以及多重比较显示MAP4K4在LS174T、SW620细胞中的表达显著升高,而在细胞HCT116. HT29中则显著降低(P<0.05)。2.3稳定干扰细胞株的建立构建了三个干扰MAP4K4基因表达的干扰片段以及阴性对照片段5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’,将干扰片段分别转染LS174T细胞,发现5’-GGGAAGGUCUAUCCUCUUATT-3’干扰片段干扰效率最高。将干扰片段以及阴性对照片段分别进行慢病毒包装。将包装产生的两种慢病毒(实验组命名为Lentivirus-shRNA-MAP4K4,对照组命名为Lentivirus-shRNA-NC)分别感染LS174T、SW620细胞株。流式细胞仪分别分选出GFP+的细胞继续进行培养。分别命名为LS174T-MAP4K4-、LS174T-NC、SW620-MAP4K4-SW620-NC。细胞培养传代一个月后经流式细胞仪检测GFP+细胞比例均达到95%以上。3. MAP4K4沉默对结直肠癌细胞株LS174T、SW620细胞生物学特性的影响3.1划痕实验检测细胞迁移能力应用倒置相差显微镜观察MAP4K4基因在不同时间,即Oh、24h、48h、72h、96h划痕区的变化情况。结果显示,划痕后96h LS174T-NC细胞的划痕间距明显窄于LS174T-MAP4K4-细胞;同时划痕后96h SW620-NC细胞的划痕间距也明显窄于SW620-MAP4K4-细胞。说明干扰MAP4K4的表达能够抑制结直肠癌细胞LS174T, SW620的运动迁移能力。3.2MAP4K4沉默对结直肠癌细胞株LS174T、SW620细胞周期的影响采用流式细胞仪的方法分别分析LS174T-NC、LS174T-MAP4K4-两组细胞以及SW620-NC、SW620-MAP4K4-两组细胞的细胞周期分布。实验结果表明,LS174T-NC、LS174T-MAP4K4-两组细胞的细胞增殖率(合成期S+合成后期G2/分裂期M)分别为58.6333%和46.6467%,MAP4K4基因沉默组LS174T-MAP4K4-与对照组LS174T-NC相比,细胞的增殖率显著降低,其差异具有统计学意义(t=12.723:P=0.000);在SW620-NC、SW620-MAP4K4-两种细胞的细胞增殖率(合成期S+合成后期G2/分裂期M)分别为50.4500%和41.7367%, MAP4K4基因沉默组SW620-MAP4K4-与对照组SW620-NC相比,细胞的增殖率显著性降低,其差异具有统计学意义(t=8.815;P=0.001)。说明MAP4K4基因的干扰抑制LS174T, SW620细胞的增殖速度。3.3平板克隆实验检测MAP4K4的沉默对细胞克隆形成能力的影响LS174T-NC、LS174T-MAP4K4-两组细胞以及SW620-NC. SW620-MAP4K4-两组细胞均能在平板中形成克隆,LS174T-NC、 LS174T-MAP4K4-两组细胞克隆形成率分别为33.3333±3.8188(%)和24.8333±2.5658(%),采用两独立样本t检验分析发现两组细胞的克隆形成能力有显著性差异(t=3.2000, P=0.033); SW620-NC, SW620-MAP4K4-两组细胞的克隆形成率分别为53.8333±2.2546(%)和47.6667±1.2583(%),采用两独立样本t检验分析发现两组细胞的克隆形成能力具有显著性差异(t==4.137,P=0.014);提示MAP4K4基因沉默后,结直肠癌细胞单个细胞的生长增殖形成克隆的能力收到了抑制。3.4CCK8细胞活性检测试验检测细胞增殖能力采用CCK8细胞活性检测试验检测MAP4K4抑制后细胞增殖能力的变化,并绘制生长曲线。析因方差分析结果显示,LS174T细胞株中两组间细胞增殖能力差异明显(F=176.432,P<0.001),两个组别生长时间水平差异具有显著性(F=596.995,P<0.001),时间与分组之间交互效应显著(F=20.833, P<0.001);SW620细胞株中两组间细胞增殖能力差异明显(F=525.133,P<0.001),两个组别生长时间水平差异具有显著性(F=1144.231,P<0.001),时间与分组之间交互效应显著(F=85.554,P<0.001);从两株细胞的增长曲线以及统计分析结果说明抑制MAP4K4能够抑制结直肠癌细胞LS174T, SW620的体外增殖能力。3.5运动小室实验检测MAP4K4的抑制对LS74T、SW620细胞运动迁移能力的影响采用Transwell小室的方法检测MAP4K4抑制后细胞体外迁移运动能力的变化,通过各组细胞穿过人工基底膜细胞数量的多少来评估各组细胞迁移运动的能力,结果发现LS174T-NC、LS174T-MAP4K4-两组细胞穿过基底膜的数量分别为13.33±1.528、8.33±1.528,其差异具有统计学意义(t=4.009, P=0.016); SW620-NC、SW620-MAP4K4-两组细胞穿过基底膜的数量分别为101.00±3.606、47.33±3.512,其差异具有显著性(t=-18.468,P=0.000)。此结果表明在结直肠癌细胞LS174T中LS174T-MAP4K4-其运动能力较SLS174T-NC明显降低,在结直肠癌细胞SW620中SW620-MAP4K4-其运动能力较SW620-NC明显降低,说明MAP4K4基因的沉默能够抑制LS174T、SW620细胞的迁移运动能力。4. MAP4K4相关信号通路的检测MAP4K4基因的沉默对结直肠癌细胞LS174T、SW620中PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路蛋白AKT、ERK2、p-AKT、p-ERK表达的影响。利用Western blot检测LS174T-NC、LS174T-MAP4K4-两组细胞以及SW620-NC、 SW620-MAP4K4-两组细胞中AKT、ERK2、p-AKT、p-ERK的表达,结果显示p-AKT和p-ERK在LS174T-MAP4K4-组细胞中的表达比LS174T-NC组降低,而AKT和ERK2总蛋白量在两组间无明显差异;p-AKT和p-ERK在SW620-MAP4K4-组细胞中的表达比SW620-NC组降低,而Akt和ERK2总蛋白量在两组间无明显差异。结论1.研究结果初步证实MAP4K4基因是结直肠癌增殖、侵袭、转移的促进基因。2.研究结果初步证实MAP4K4可能通过参与PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的调控,从而促进大肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。

全文目录


摘要  3-10
ABSTRACT  10-17
前言  17-26
  参考文献  21-26
技术路线  26-27
第一章 MAP4K4结直肠癌组织中的表达及预后意义  27-40
  一、材料和方法  27-29
  二、结果  29-34
  三、讨论  34-37
  参考文献  37-40
第二章 MAP4K4基因沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响  40-84
  一、材料与方法  40-52
  二、结果  52-76
  三、讨论  76-80
  参考文献  80-84
第三章 MAP4K4参与的信号通路的初步研究  84-95
  一、材料和方法  84-86
  二、结果  86-88
  三、讨论  88-91
  参考文献  91-95
全文总结  95-96
硕士期间发表论文  96-97
致谢  97-98

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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