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miR-181b和miR-182对胃腺癌细胞生长的影响及其靶基因研究

作 者: 孔卫青
导 师: 刘民
学 校: 天津医科大学
专 业: 病原生物学
关键词: microRNA miR-181b miR-182 胃腺癌 靶基因CREB1
分类号: R735.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


[研究目的]微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约18-26nt的小分子非编码RNA,通过负性调节其靶基因的表达水平参与多种生理、病理过程。近几年的研究表明,许多miRNA具有癌基因或抑癌基因活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。实验室前期工作利用寡核苷酸微阵列技术发现在人胃腺癌组织中microRNA-181b(miR-181b),microRNA-182(miR-182)表达水平发生明显下调,本研究应用Real-time PCR技术验证了这一结果,然后研究了miR-181b, miR-182对几种胃腺癌细胞生长表型的影响,进一步确定miR-181b,miR-182直接作用的共同靶基因,从而阐明miR-181b,miR-182对胃腺癌发生和发展发挥作用的可能分子机制。[方法]首先应用Real-time PCR技术检测miR-181b,miR-182在人胃腺癌组织和癌旁正常组织中的差异表达以验证寡核苷酸微阵列结果,然后在三种人胃腺癌细胞系MGC803、SGC790、BGC823细胞中,过表达miR-181b,miR-182,利用MTT实验和细胞集落形成实验检测细胞生长活性的变化。之后综合利用生物信息学方法和cDNA微阵列技术筛选出miR-181b,miR-182的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-181b,miR-182对其靶基因的直接调控作用。通过Real-time PCR和Western blot技术检测胃腺癌细胞和胃腺癌组织中内源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-181b,miR-182对靶基因的调控作用。最后利用RNA干扰技术将靶基因的表达沉默后,通过MTT实验和细胞集落形成实验检测细胞生长活性的变化,进一步研究靶基因的功能。[结果]Real-time PCR结果显示,miR-181b,miR-182在人胃腺癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织,与寡核苷酸微阵列结果一致。在三种胃腺癌细胞中,过表达miR-181b,miR-182增强其功能后,细胞增殖均明显受抑制,并且集落形成能力均明显降低。靶基因筛选结果表明,核转录因子cAMP反应元件结合蛋白1(cAMP responsive element binding protein1,CREB1)作为一种癌基因,是miR-181b,miR-182的共同候选靶基因,其3’非翻译区包含miR-181b,miR-182的潜在结合位点,两结合位点不同。荧光报告载体实验表明,miR-181b,miR-182能够通过作用于CREB1基因的3’非翻译区(3’ untranslated region,3’UTR)的特定位点,对其表达进行负性调节。而在miR-181b,miR-182过表达的胃腺癌细胞中,CREB1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降,在胃腺癌组织中CREB1基因的mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织,与cDNA微阵列结果一致。将CREB1基因沉默以后,细胞增殖均明显受到抑制,细胞集落形成能力均明显降低。[结论]miR-181b,miR-182能够抑制胃腺癌细胞的增殖,起到抑癌基因的作用。在胃腺癌细胞中,低表达的miR-181b,miR-182对癌基因CREB1表达水平的抑制能力降低,使CREB1的促增殖活性增强,造成胃腺癌细胞生长速度加快。通过阐明miR-181b,miR-182在胃腺癌中的具体作用机制及其靶基因的研究有利于我们对胃腺癌的发生发展进行深入的理解,同时也为临床上胃腺癌的诊断和治疗提供新的方向。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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