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miR-9、let-7b和let-7g调控Cthrc1基因影响胃癌增殖转移的实验研究

作　者: 虞俊波
导　师: 徐泽宽
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胃癌 微小RNA SGC-7901 Cthrc1
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


胃癌是最常见的肿瘤之一,亚洲发病率最高,尤其是韩国、日本和中国。胃癌在全世界肿瘤发病率中居第四位,导致的死亡中列第2位。据统计,2008年全球新发生的胃癌病例大约是989,000例,死亡738,000例。幽门螺杆菌(H.pylori, HP)被归为是胃癌的Ⅰ类致癌原。微小RNA (miRNA, microRNA)是一类20-22碱基大小的小分子非编码RNA,在转录后水平调节目的基因的表达。MiRNA参与细胞生长、分化、凋亡和增殖的调控。越来越多的证据表明,miRNAs的差异表达在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,一些表现为癌基因的作用,一些类似抑癌基因。胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing1, Cthrc1)基因最早是在动脉损伤过程中筛选出的一种过表达基因,Cthrc1可减少胶原沉积,并促进细胞迁移。最近发现Cthrc1在人类癌症如乳腺癌和黑素瘤中过度表达,参与肿瘤的侵袭和转移过程,但是具体机制仍不明确。本实验目的在于通过miRNA表达谱芯片技术,筛选胃癌组织中差异表达的miRNAs,并分析其和HP的相关性,为胃癌的诊断和治疗提供理论基础,然后进一步研究这些miRNAs调控胃癌细胞增殖转移的机制。方法：胃癌中miRNAs表达谱的筛选和验证1、采用TaqMan microarray芯片技术筛选胃癌组织中384个miRNAs的表达情况,挑选出明显差异表达的miRNAs,在47对胃癌及对应正常胃粘膜组织采用real-time PCR验证芯片结果；2、以HP为相关因素分析miRNAs的差异表达,通过HP刺激细胞来观察miRNAs的表达差异。miR-9、let-7b、let-7g调控Cthrc1基因影响胃癌的增殖转移1、生物信息学预测iR-9、let-7b、let-7g的靶基因,免疫组化、western-blot以及qRT-PCR检测靶基因在胃癌中的表达,分析靶基因表达与临床病理学参数之间的关系。2、体外转染miR-9、let-7b、let-7g模拟物及抑制物,荧光素酶报告基因实验检验这三个miRNAs与Cthrcl3’-UTR的直接靶向关系,western blot检测其对Cthrc1蛋白水平的影响。3、构建Cthrc1过表达/干扰的慢病毒载体,转染至胃癌细胞中,利用MTT研究Cthrc1对胃癌细胞增殖的影响,Transwell法检测Cthrc1对胃癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果：胃癌中miRNAs表达谱的筛选和验证1、芯片结果显示let-7b、let-7g、miR-9、miR-133a、miR-133b、miR-139-5p、 miR-141、miR-145、miR-204及miR-212在胃癌组织中低表达；2、qRT-PCR进一步验证显示let-7b、let-7g、miR-9和miR-204在胃癌组织中显著下调,并且let-7b、let-7g、miR-9在HP阳性的组织中表达更低；3、胃癌细胞SGC-7901中let-7b、let-7g和miR-9的表达较GES-1明显下调,HP刺激后下降更明显。miR-9、let-7b、let-7g调控Cthrc1基因影响胃癌的增殖转移1、生物信息学预测Cthrc1是miR-9、let-7b、let-7g的共同靶基因,免疫组化结果显示Cthrcl在胃癌组织中高表达,且与胃癌的淋巴结转移相关。Western-blot及qRT-PCR检测胃癌细胞株中Cthrc1的表达,发现胃癌细胞中Cthrc1表达升高,以SGC-7901最明显。2、通过转染]miR-9、let-7b、let-7g的模拟物、抑制物以及荧光素酶报告基因实验,证实Cthrc1是miR-9、let-7b、let-7g共同的特异性靶基因之一3、过表达Cthrc1的GES-1细胞增殖侵袭和迁移能力加强,干扰表达Cthrc1的SGC-7901细胞增殖侵袭和迁移能力减弱。结论：1、miR-9、let-7b和let-7g在胃癌组织中低表达,且HP阳性的胃癌组织和细胞表达更低。2、Cthrc1是miR-9、let-7b和let-7g共同的特异性靶基因之一。3、miR-9、let-7b和let-7g在胃癌组织和胃癌细胞株中低表达,导致对Cthrc1的抑制作用减弱,Cthrc1的表达升高,促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

全文目录


缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-14
前言  14-17
第一部分 胃癌中miRNAs表达谱的筛选和验证  17-52
  材料与方法  17-28
  结果  28-36
  分析与讨论  36-52
第二部分 miR-9、let-7b、let-7g调控Cthrc1基因影响胃癌的增殖转移  52-79
  材料与方法  52-67
  结果  67-75
  分析与讨论  75-79
结论  79-81
参考文献  81-93
综述  93-111
  参考文献  104-111
攻读学位期间发表文章情况  111-112
致谢  112

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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