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KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药中的作用及机制研究

作　者: 张慧
导　师: 张宏博
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: KLF8 多药耐药 胃癌细胞 缺氧
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


胃癌是我国死亡人数最多的恶性肿瘤之一，其主要治疗方法有手术治疗、放化疗及生物学治疗等。然而，化疗导致胃癌多药耐药现象的产生仍是我们面临的一个严峻问题。产生多药耐药有很多因素，其中肿瘤组织中微环境的形成对肿瘤细胞多药耐药性的产生起着重要的诱导作用。缺氧是肿瘤组织生长的重要微环境，有多种分子参与了缺氧条件下肿瘤细胞的多药耐药，但是仍未能有效逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药，其主要原因是分子机制尚不明确。因此，寻找参与缺氧诱导耐药的分子及阐明其分子机制至关重要，能为肿瘤的治疗开辟出一条新的道路。Kruppel-like factor8(KLF8)是我们前期通过Cellomics平台进行胃癌细胞功能筛选获得的胃癌相关新分子。有文献提示KLF8在缺氧诱导因子高表达的肾透明细胞癌中呈高表达状态，提示该分子可能是一个缺氧反应分子，那么它会不会是缺氧与耐药之间一个关键分子呢，这是我们研究的重点。因此，深入探讨缺氧条件下KLF8在胃癌细胞发生多药耐药中的作用机制，将使我们更加全面了解缺氧条件下胃癌细胞发生多药耐药的机制。目的：研究KLF8在胃癌细胞多药耐药表型中的作用；探讨缺氧条件下胃癌细胞中KLF8表达变化；构建KLF8过表达及低表达的胃癌细胞亚系，研究KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用；进一步研究KLF8对多耐药相关基因的调控作用及机制。方法：1.常氧和缺氧条件下，分别通过体外药敏实验（MTT实验）、凋亡实验（Annexin V/PI染色法）及阿霉素蓄积与潴留实验检测胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性；2.利用Western blot和实时定量PCR的方法检测三株胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901在常氧及缺氧条件下KLF8的表达水平；3.用Western blot和实时定量PCR的方法检测胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和亲本细胞系SGC7901中KLF8的表达水平；4.构建KLF8正义表达载体及KLF8小干扰RNA的慢病毒载体，将其转染入实验细胞中，用Western blot和实时定量PCR的方法检测KLF8表达量的变化；5.用MTT、Annexin V/PI染色法及阿霉素蓄积量与潴留实验检测KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用；6.用Western blot方法检测KLF8过表达和低表达的胃癌细胞在常氧及缺氧条件下P-gp、Bcl-2和Bax三种蛋白的表达水平；7.生物信息学预测耐药相关基因MDR1的转录调控位点，利用双荧光素酶报告基因实验检测KLF8对MDR1的转录调控作用。结果：1.缺氧条件下，胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性增强，化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数降低，药物泵出率增加（p<0.05）；2.缺氧可诱导胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901中KLF8的表达升高；3.与胃癌亲本细胞系相比，KLF8在胃癌耐药细胞系中的表达升高，并且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显；4.外源性转染KLF8后可显著增加胃癌细胞中KLF8的表达量，KLF8小干扰RNA可有效降低常氧及缺氧条件下胃癌细胞中KLF8的表达；5.常氧条件下，外源性转染KLF8的正义表达载体可增加胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性，降低化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数，同时可增加细胞内阿霉素的泵出率。缺氧条件下，KLF8小干扰RNA能够逆转胃癌细胞中上述现象的发生；6. KLF8过表达的胃癌细胞中Bcl-2及P-gp的蛋白表达水平增加，而Bax的水平降低，KLF8低表达的胃癌细胞中Bcl-2及P-gp的表达降低，而Bax的表达增强；7.在MDR1转录起始位点上游-169bp处存在两个KLF8结合位点（CACCC盒），KLF8可与该结合位点结合促进MDR1转录，介导缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型的发生。结论：1.缺氧显著增加胃癌细胞对化疗药物的耐受性；2.缺氧条件下胃癌细胞中KLF8表达量显著增加；3.缺氧条件下，胃癌细胞通过缺氧/KLF8信号通路产生了多药耐药的表型；4. KLF8诱导胃癌细胞多药耐药的产生主要是通过上调Bcl-2/Bax的比率降低化疗药物诱导胃癌细胞的凋亡指数，以及通过上调P-gp的蛋白表达量增加化疗药物的外排来实现的；5. KLF8可与耐药相关基因MDR1转录起始位点上游的KLF8结合位点结合，对MDR1发生转录调控作用，进一步明确了KLF8参与胃癌细胞多药耐药的分子机制。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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