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JMJD2B在胃癌侵袭转移中的作用研究以及幽门螺杆菌感染对JMJD2B表达调控的研究

作　者: 赵丽
导　师: 贾继辉
学　校: 山东大学
专　业: 病原生物学
关键词: 幽门螺杆菌胃癌 JMJD2B 上皮-间质转化转移
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,位居全球癌症相关的死亡率第二位。虽然胃癌整体发病率在美国有所下降,但在亚洲国家发生率仍然偏高。侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征之一,胃癌一旦进入晚期或转移性阶段,手术和联合化疗对于提高患者的生存率起效甚微。因此,更透彻地揭示胃癌的发生及发展的机理是当务之急。确定新的诊断和预后指标,寻找新的药物治疗靶点进行有针对性的治疗至关重要。肿瘤的侵袭转移是一个多因素、多步骤的复杂的生物学过程。其中上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是启动上皮类型肿瘤侵袭转移的关键机制。上皮-间质转化,是指上皮细胞呈现细胞间粘附下降,转化为具有迁移特性的间质表型细胞的生物学过程,是癌症的侵袭和转移的关键。其主要的特征有上皮标记细胞黏附分子(如E-cadherin)表达下降、β-catenin异常转位和间质化标记的异常上调表达(像Vimentin, N-cadherin等等)。通过EMT,与基底膜正常相互作用的具有极性的、不可活动的上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜的连接等上皮表型,获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。因此,EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。JMJD2B,又称KDM4B,属于JMJD2蛋白家族,是含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶。JMJD2B主要靶向组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基(H3K9me3)使其发生去甲基化,在许多生物学过程中发挥重要作用,如异染色质的形成,X染色体失活,同源异型基因沉默和基因转录调控等。近来,表观遗传分子JMJD2B在肿瘤发生中的作用受到越来越多的关注,JMJD2B在干细胞分化,炎症,和多种恶性肿瘤如乳腺癌,胃癌,结直肠癌,膀胱癌和肺癌的形成中发挥重要的表观遗传学作用。本实验组之前研究表明胃癌组织中存在JMJD2B的过度表达,抑制其活性将抑制胃癌细胞增殖和存活,参与了胃癌的发生,但是JMJD2B是否通过EMT进程参与了胃癌进展以及JMJD2B参与胃癌发生发展的分子机制引起了我们极大的兴趣。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染是导致胃炎、胃溃疡和胃癌的发生甚至侵袭转移至关重要的病原因素。幽门螺杆菌,长期定植于胃粘膜上皮细胞,导致宿主发生慢性萎缩性胃炎、消化道溃疡,不典型增生乃至胃癌。因此,感染幽门螺杆菌是胃癌发生的危险因素,已经被世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌因子。然而,幽门螺杆菌感染导致的胃癌的发生发展过程中所涉及的分子机制尚未完全明了。细菌和病毒引起的组蛋白重塑是促进癌症发生发展的一个机制.幽门螺杆菌诱导胃癌细胞组蛋白H3K9的二甲基降低,组蛋白去甲基化酶JMJD2B主要靶向组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基(H3K9me3)使其发生去甲基化调节基因的转录,参与胃癌的发生发展。因此探讨幽门螺杆菌感染对JMJD2B的表达影响,不仅更加深入的揭示幽门螺杆菌感染的致癌机理而且补充了JMJD2B在胃癌的发生发展中的作用机制。研究目的本研究目的是探讨组蛋白去甲基化酶JMJD2B通过促进EMT进程在胃癌的进展过程中的作用和胃癌细胞中幽门螺杆菌感染对JMJD2B表达的调控作用,并且揭示了JMJD2B参与胃癌发生发展的相关分子机制。研究方法和结果第一部分JMJD2B协同作用β-catenin促进上皮-间质转化增强胃癌侵袭转移具有较强侵袭能力的胃癌细胞HGC27和MGC803转染特异性靶向JMJD2B的小干扰RNA封闭JMJD2B的表达,发现细胞由疏松的长梭形间质样表型向紧密的鹅卵石样的上皮表型转变。这提示JMJD2B可能参与胃癌的EMT进程。为研究JMJD2B是否参与胃癌细胞EMT进程,Western blot和Real time PCR方法检测敲除JMJD2B,EMT相关的间质化标记像vimentin和snail的表达明显下调,而上皮化标记E-cadherin的表达明显上调,而过表达JMJD2B得到同上相反的结果。由此我们考虑JMJD2B通过调节EMT促进胃癌的侵袭转移。为进一步揭示JMJD2B促进胃癌细胞EMT进程的机制,我们用启动子双荧光素酶实验检测了BGC823细胞,发现抑制JMJD2B表达降低了vimentin启动子VimPro-Luc启动子活性,而对突变的vimentin启动子VimProMut-Luc (β-catenin/TCF结合位点失活)启动子活性降低程度减弱,过表达JMJD2B得到相反的结果,因此初步推测JMJD2B是依赖β-catenin途径,通过调节vimentin启动子活性介导vimentin转录表达促进EMT进程。免疫共沉淀和染色质免疫沉淀方法检测JMJD2B物理性的结合β-catenin,被招募到vimentin启动子上转录激活vimentin表达从而调节EMT,进一步证实了上述机制。不仅如此,免疫荧光实验显示敲除JMJD2B能减弱TGF-β介导的β-catenin的核聚集抑制vimentin转录,更进一步揭示了JMJD2B调节EMT进程的机制。我们通过通过创伤划痕实验和transwell基质胶侵袭实验发现抑制JMJD2B的表达后,HGC27和MGC803细胞的运动能力和侵袭能力明显减弱,从体外水平证明了JMJD2B与胃癌的侵袭转移能力相关。裸鼠尾静脉注射JMJD2B敲除的胃癌细胞肺转移模型从体内水平检测JMJD2B对胃癌侵袭转移的作用。我们使用101例胃癌组织标本通过免疫组织化学方法检测JMJD2B和vimentin表达水平,结果表明,JMJD2B的表达和胃癌的大小(P=0.017),分化程度(P=0.002),肿瘤的侵袭(P=0.045),淋巴结的转移状态(P=0.000),远端转移(P=0.024),TNM分期(P=0.002)和vimentin表达(P=0.004)相关。第二部分幽门螺杆菌感染对JMJD2B表达的调控作用在本实验中,我们用Western blot和Real time PCR方法检测幽门螺杆菌26695菌株感染胃癌细胞(细菌：细胞=100：1)0.5,1,1.5和2h, JMJD2B表达上调,同时COX-2的表达也随之上调。靶向JMJD2B的siRNA转染胃癌细胞,抑制JMJD2B表达后再用幽门螺杆菌感染细胞,JMJD2B又升高,同时还伴随着COX-2蛋白表达也上调,为更进一步研究JMJD2B在幽门螺杆菌感染下调控JMJD2B的表达促进胃癌发生发展的分子机制,胃癌细胞抑制JMJD2B表达,COX-2也随之表达下调,证明JMJD2B在幽门螺杆菌诱导下正性调控COX-2,这与原发性胃癌标本免疫组化的结果相吻合：JMJD2B和COX-2在原发性胃癌中高表达。结论本研究深入探讨JMJD2B促进胃癌侵袭转移作用及分子机制和幽门螺杆菌感染对表观遗传学分子JMJD2B表达的正性调控作用,揭示了JMJD2B在胃癌发生、发展中的关键作用,表明抑制JMJD2B表达是抗肿瘤的可能机制之一,提示JMJD2B可能作为一种新的抗癌治疗的靶点。在胃癌的诊断与治疗中有广泛的应用前景。

全文目录

中文摘要  6-10
英文摘要  10-16
符号说明  16-18
前言  18-27
  参考文献  22-27
第1章 JMJD2B协同作用β-catenin促进上皮-间质转化增强胃癌侵袭转移  27-75
  实验材料  28-37
  实验方法  37-50
  实验结果  50-54
  讨论  54-56
  结论  56-57
  附图  57-70
  参考文献  70-75
第2章幽门螺杆菌感染对JMJD2B表达的调控  75-94
  实验材料  76-79
  实验方法  79-82
  初步实验结果  82-84
  讨论  84-86
  结论  86-87
  附图  87-91
  参考文献  91-94
论文总结与结论  94-95
致谢  95-96
已发表和正在整理的论文  96-97
附件  97-98
英文论文  98-125
  References  113-125

JMJD2B在胃癌侵袭转移中的作用研究以及幽门螺杆菌感染对JMJD2B表达调控的研究

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