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H.pylori通过IL-1β诱导胃癌相关基因异常甲基化的研究

作　者: 王永琦
导　师: 李玉民
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 胃癌 幽门螺杆菌 DNA甲基化 IL-1β TGF-β1 DNA甲基转移酶
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：通过检测临床胃癌组织标本TGF-β/Smad信号通路关键基因TGF-β1、 Smad4及Smad7启动子甲基化水平,以发现胃癌中新的异常甲基化基因,为寻找胃癌生物学标志提供临床证据,并以此为基础,通过体外实验探讨H.pylori诱发胃癌相关基因异常甲基化机制。方法：(1)实验组,选择47例临床胃癌手术患者癌组织及癌旁正常胃黏膜组织标本94份；对照组,选择非胃癌行胃镜检查人群正常胃黏膜组织标本39份,利用快速尿素酶实验及细菌分离培养诊断受检标本H.pylori感染状况；采用Real time-PCR及免疫组化方法检测获取组织标本IL-1βmRNA及蛋白表达情况；采用特异性甲基化PCR (MSP)方法检测获取标本TGF-β1, Smad4和Smad7启动子甲基化状态及水平,统计分析胃癌组织中TGF-β1, Smad4和Smad7甲基化频率、水平及其与H.pylori感染和IL-1β的相关性。(2)通过体外实验研究H.pylori和IL-1β对胃癌相关基因CpG岛启动子区甲基化的影响。①按照不同H.pylori细胞比进行H.pylori和胃黏膜正常细胞GES-1及胃癌细胞MKN-45体外共培养(12h,24h,48h),利用MSP方法检测两种细胞TGF-β1, COX-2, p14ARF, RASSFIA启动子甲基化水平变化；②利用不同浓度的IL-1β及IL-1受体阻断剂(IL-lRA)体外刺激GES-1及MKN-45细胞,采用MTT, MSP方法检测两种细胞细胞增殖水平及TGF-β1, COX-2, p14ARF, RASSFIA启动子甲基化水平变化,同时采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测两种细胞甲基转移酶活性变化,明确IL-1β对两种细胞的增殖作用及对四种胃癌相关基因甲基化状态和甲基转移酶活性的影响,探讨IL-1β诱发相关基因甲基化机制。结果：①47例胃癌患者中H.pylori阳性患者38例,感染率80.85%,39例非胃癌人群H.pylori(?)阳性患者22例,感染率56.41%,H.pylori阳性胃黏膜组织及胃癌组织IL-1β表达较H.pylori阴性胃黏膜组织及非胃癌组织明显增加(p<0.05)；H.pylori阳性胃黏膜组织及胃癌组织TGF-β1启动子甲基化频率及甲基化水平较H.pylori阴性胃黏膜组织及非胃癌组织明显增加(p<0.05)；所有获取组织标本均未能检测到Smad7甲基化改变。②不同浓度比H.pylori分别与GES-1和MKN-45细胞共培养12h,24h,48h后,经MSP方法均未检测到两种细胞四种基因启动子甲基化状态的改变：③不同浓度IL-1β作用于GES-1和MKN-45细胞,两种细胞增殖水平显著增加(P<0.05),甲基转移酶活性随着IL-1β浓度增加而增加；④IL-1β刺激GES-1细胞TGF-β1启动子甲基化水平增加,且能够被IL-IRA预处理部分阻断；IL-1β刺激MKN-45细胞未检测到TGF-β1甲基化条带；⑤IL-1β刺激GES-1细胞COX-2mRNA及蛋白表达增加,启动子出现去甲基化改变,IL-1β刺激MKN-45细胞未检测到COX-2甲基化改变；⑥经IL-1β作用后,两种细胞RASSFIA、p14ARF启动子甲基化未发生甲基化改变。结论：①H.pylori阳性胃癌组织TGF-β1启动子高甲基化,提示TGF-β1甲基化可能是TGF-β/Smad信号通路在H.pylori相关胃癌的机制之一；②H.pylori不能直接诱发胃癌相关基因甲基化,该作用可能通过炎性细胞因子IL-1p增加DAN甲基转移酶活性介导；③IL-1p对不同胃癌相关基因甲基化作用具有差异性,提示IL-1β可能通过多条途径作用于不同胃癌相关基因。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-7
縮略语  7-8
目录  8-9
引言  9-14
第一部分 胃癌组织TGF-β 1、Smad4及Smad7甲基化研究  14-38
  1.1 实验材料  16-18
  1.2 实验方法及步骤  18-27
  1.3 结果  27-34
  1.4 讨论  34-37
  1.5 结论  37-38
第二部分 IL-1β介导H.pylori诱发GES-1、MKN-45细胞胃癌相关基因异常甲基化的研究  38-64
  2.1 实验材料  39-40
  2.2 实验方法及步骤  40-50
  2.3 结果  50-57
  2.4 讨论  57-63
  2.5 结论  63-64
第三部分 结论  64-66
  3.1 主要结论  64
  3.2 研究展望  64-66
参考文献  66-73
附图  73-75
综述：胃癌相关基因甲基化研究进展  75-91
  参考文献  86-91
在学期间研究成果  91-92
致谢  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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