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MicroRNA-373诱导E-钙粘蛋白表达及其对肺癌A549细胞生长的影响

作　者: 武卫华
导　师: 叶彬
学　校: 重庆医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: has-mir-373 E-钙粘蛋白基因表达 A549细胞裸鼠移植瘤
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:人工构建hsa-mir-373真核表达载体并转染肺癌A549细胞，通过体外细胞转染实验和体内裸鼠移植瘤实验探讨对肿瘤细胞中E-钙粘蛋白表达、肿瘤细胞周期及迁移粘附的影响。方法:依据miRBase数据库中hsa-mir-373序列，设计mir-373序列片段，设计时在序列内加入相应的酶切位点，以利于后期的鉴定。同时设计一对照序列，设计好的片段进行Blast比对以确保与现有序列没有同源性。片段合成后，经过退火并形成双链通过连接酶插入pGenesil-1真核表达载体中。采用脂质体转染方法分别将重组mir-373质粒和对照质粒转染肺癌A549细胞，转后用荧光显微镜观察转染效果。转染重组mir-373质粒A549细胞和对照质粒A549细胞采用G418筛选，建立稳定表达mir-373及对照序列的细胞系。荧光定量PCR检测未转染A549细胞、转染对照质粒A549细胞及转染重组mir-373A549细胞中mir-373的表达水平。RT-PCR、Weshern blot检测各组细胞中E-钙粘蛋白mRNA及蛋白的表达；运用免疫细胞化学方法检测细胞中E-钙粘蛋白表达和分布；采用MTT法检测各组增殖能力；运用流式细胞术分析各组细胞的细胞周期；采用体外划痕实验检测细胞的体外迁移能力。将未转染A549细胞、转染对照质粒A549细胞及转染重组mir-373质粒A549细胞分别接种于裸鼠背部皮下，观察各组细胞在裸鼠体内的成瘤率、肿瘤生长速度及大小。30天后处死裸鼠，完整剥离肿瘤，称量肿瘤重量。Western blot及免疫组织化学检测各组肿块中E-钙粘蛋白的表达差异。结果:酶切和测序表明设计的重组mir-373质粒和对照序列质粒构建成功。转染后在荧光显微镜下可观察到细胞中发出荧光。经G418筛选获得了可以稳定表达mir-373序列及对照序列的细胞系。荧光定量PCR结果证实，与未转染空白细胞和转染对照质粒细胞相比，转染了重组mir-373的细胞中mir-373的表达量增加。MTT结果显示转染重组mir-373质粒A549细胞增殖能力减弱，细胞生长能力减低。各组细胞经流式细胞仪检测其细胞周期变化没有明显的差异。RT-PCR和Western blot结果显示：与转染对照质粒和未转染的细胞相比，转染了重组mir-373质粒的A549细胞中E-cadherin蛋白的表达明显增加（P<0.01），半定量分析显示E-cadherin蛋白的表达增加了大约40%。免疫细胞化学发现E-cadherin表达增多，其分布遍布整个胞浆中。实验组中经过24小时后，空白组和对照组细胞划痕基本愈合，而实验组划痕依然明显。空白组和对照组的裸鼠移植瘤生长较快，实验组移植瘤生长速度明显减慢，瘤体体积和重量显著降低。转染重组mir-373质粒的A549细胞移植瘤组织标本中E-cadherin的表达明显增加。结论: hsa-mir-373在体外实验中可上调E-cadherin蛋白的表达，并可以抑制肺癌A549细胞的迁移，但却不影响肿瘤细胞周期的变化。重组mir-373质粒转染的肿瘤细胞在体内的生长要能显著抑制肺癌A549细胞在体内的生长能力

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-15
第一部分重组 hsa-miR-373 真核表达质粒的鉴定、转染及转染后稳定表达细胞的筛选  15-36
  1.材料、方法  15-28
  2.结果  28-32
  3. 讨论  32-35
  小结  35-36
第二部分 mir-373 影响 A549 细胞 E-cadherin 表达及细胞生长的研究  36-56
  1 材料与方法  36-46
  2 结果  46-52
  3 讨论  52-55
  小结  55-56
第三部分 mir-373 影响 A549 细胞裸鼠移植瘤的生长  56-67
  1. 材料和方法  56-61
  2 结果  61-65
  3 讨论  65-66
  小结  66-67
全文总结  67-68
创新点和特色  68
存在问题与展望  68-69
参考文献  69-74
文献综述  74-81
  参考文献  78-81
致谢  81-82
攻读博士学位期间发表的论文和承担科研项目情况  82-83

MicroRNA-373诱导E-钙粘蛋白表达及其对肺癌A549细胞生长的影响

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