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目的：肺癌是发生率和死亡率居于首位的恶性肿瘤,晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗效果更不理想。吉非替尼是一种表皮生长因子受体—酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TK1),它能有效抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、转移并能抑制肿瘤新生血管的形成。随着近些年EGFR-TKI临床应用的深入,EGFR-TK业已成为EGFR突变阳性的晚期非小细胞肺癌的一线首选治疗方法,但随之发现的耐药问题成为了限制EGFR-TKI疗效的一大难题,因此,寻找能够增加EGFR-TKI疗效、甚至能解决其耐药的方法成为了目前研究的热点。康莱特注射液是传统的中药抗肿瘤制剂,一些研究发现,康莱特联合化疗能显著提高晚期非小细胞肺癌的治疗效果,有协同增效、增敏甚至逆转耐药的作用。大量临床研究发现,PI3K/AKT通路被持续活化,抑制肿瘤细胞的凋亡是吉非替尼疗效受限的一个重要作用机制。本实验应用MTT方法、流式细胞学、免疫组织化学,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,检测吉非替尼、康莱特作用于人肺腺癌A549细胞株后对细胞增殖抑制、凋亡率、FAS. AKT2mRNA及蛋白等的表达来探索吉非替尼联合康莱特对A549细胞株的作用及其机制。方法：1体外培养人肺腺癌A549细胞,选取对数生长期细胞进行实验。实验分为空白对照组,吉非替尼组,康莱特组,吉非替尼联合康莱特组；吉非替尼组设置浓度梯度为：0.1、0.5、1、5、10、20、40umol/L,作用时间分别为24h、48h、72h;康莱特设置浓度梯度为：5、10、20、40、80、100.160ul/ml,作用时间：24h、48h、72h；联合组：根据康莱特48h抑制率求IC50,分别与各浓度吉非替尼联合作用24h、48h、72h；应用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay MTT)法分别测定各药物不同浓度,不同作用时间的抑制率。2根据康莱特48h抑制率,得IC50=80ul/ml,故联合用药组康莱特取80ul/ml,吉非替尼选择本实验中最高作用浓度40umol/L,共同处理48h后,应用流式细胞学检测各处理组中细胞凋亡率情况。3选取对数生长期细胞置入六孔板培养,分别加入吉非替40umol/L培养48h,康莱特80ul／ml培养48h,两药联合培养48h,培养后细胞爬片,应用S-P免疫组织化学方法检测FAS、AKT2蛋白的表达。4取对数生长期细胞,调整细胞浓度为5×104/m1接种于培养瓶中,根据对照组与实验组分别加入药物作用48h后提取RNA,检测总RNA的量、纯度及完整性,反转录合成cDNA,设计引物,通过聚合酶链反应将cDNA扩增,扩增产物经过电泳,应用凝胶成像系统及分析软件对FAS-mRNA、 AKT2-mRNA进行分析。结果：1MTT结果显示：1.1用MTT法测康莱特单药作用于人肺腺癌A549细胞株时的细胞抑制率与对照组比,随着康莱特浓度(5、10、20、40、80、100、160ul/ml),细胞抑制率明显增加,P<0.05,差异有统计学意义；每个药物浓度随着作用时间的延长(24h、48h、72h),对A549细胞的抑制率逐渐升高,P<0.05,差异有统计学意义；表明康莱特单药对人肺腺癌A549细胞株的抑制作用有剂量效应及时间效应依赖关系；1.2用MTT法测吉非替尼作用于人肺腺癌A549细胞株时的细胞抑制率当作用时间为24h时,随着药物浓度(0.1、0.5、1、5、10、20、40umol/L)的增加,吉非替尼对A549细胞的增殖无明显的抑制作用,P>0.05,差异无统计学意义；当作用时间>24h,P<0.05,差异有统计学意义；药物浓度随着作用时间的增加(24h、48h、72h),细胞抑制率并未明显增加,P>0.05,差异无统计学意义。表明吉非替尼单药对人肺腺癌A549细胞株无明显的浓度、时间依赖。1.3MTT法检测康莱特联合吉非替尼对人肺腺癌A549细胞株的抑制率康莱特联合吉非替尼作用于A549细胞后,其细胞抑制率高于单药组,随着吉非替尼浓度的增加,其细胞抑制率逐渐增加,P<0.05,差异有统计学意义；随着两药联合作用时间的增加,对细胞的抑制率亦逐渐增加,P<0.05,差异有统计学意义；求得康莱特48小时IC50=80ul/ml,分别联合不同浓度吉非替尼作用24h、48h、72h后,随着时间的增长,在一定浓度范围内两药联合表现出协同抑瘤作用。2流式细胞学结果显示：各处理组作用于细胞48h后,与对照组相比,单药康莱特组、联合用药组细胞凋亡率均有显著性差异(P<0.05)；联合组的细胞凋亡率显著高于单纯康莱特组、单纯吉非替尼组,P=<0.05,差异有显著性；但单药吉非替尼组与对照组无明显差异。3免疫组织化学检测结果显示：与对照组相比,康莱特组FAS蛋白阳性表达率为：50.00%,联合组FAS蛋白阳性表达率为58.33%,较对照组阳性表达率增加,经x2检验,P<0.05,差异有统计学意义；吉非替尼组与对照组相比,P>0.05,无统计学意义。康莱特组AKT2蛋白阳性表达率为：33.33%,较对照组下调；联合组AKT2蛋白阳性表达率：16.67%,较对照组下调,经x2检验,P<0.05,差异有统计学意义；吉非替尼组与对照组相比,P>0.05,无统计学意义。4RT-PCR结果显示：与对照组相比,康莱特组FASmRNA水平上调,AKT2mRNA水平下调,P<0.05,差异有统计学意义；联合组FASmRNA较对照组明显增加,AKTmRNA较对照组显著下调,P<0.05,差异有统计学意义；结论：1康莱特单药对人肺腺癌A549细胞株有显著的抑制作用,并呈剂量—时间依赖性；2吉非替尼单药对人肺腺癌A549细胞株有微弱的抑制作用,无明显的浓度-时间依赖性。3康莱特可增加吉非替尼对人肺腺癌A549细胞株的增殖抑制率,促进细胞凋亡,两药联合一定范围内呈现协同抑瘤作用。4康莱特联合吉非替尼可能通过影响PI3K/AKT通路上AKT2蛋白的磷酸化,降低AKT2对下游凋亡蛋白FAS蛋白磷酸化的控制,进而增加细胞表面FAS蛋白的表达,促进FAS与其受体FASL的结合,最终导致细胞凋亡。
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