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Orai1和STIM1在姜黄素诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡中的作用

作　者: 林丹苗
导　师: 邹飞
学　校: 南方医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: STlM1 Orail 姜黄素细胞凋亡非小细胞肺癌
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景肺癌是我国发病率、死亡率最高的癌症。过去30年我国肺癌死亡率上升465%,卫生部统计数据显示,肺癌已经成为中国恶性肿瘤的第一位死亡原因。非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85%,与小细胞癌相比,其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。近些年,在化疗的成效上,非小细胞肺癌确实有显著的进步,无论是从肿瘤缩小的局部控制率上(单一药物反应率10-30%,两种化疗药物治疗反应率35-45%),还是从缓和病程进展、改善症状方面都有所突破,然而在延长病患存活时间上,即使配合放射治疗、手术等,仍无明显进展。因此,寻找效果更好的药物来预防和治疗肺癌是目前亟待解决的问题。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分,其中,姜黄约含3-6%,是植物界很稀少的具有二酮的色素,为二酮类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末,味稍苦。现代研究发现姜黄素可以抑制炎症反应、抗氧化、抗类风湿的作用。美国VITY维他命杂志报道：“姜黄素的主要药理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等。”美国肿瘤研究所将其列为第三代癌化学预防药。姜黄素抗肿瘤的作用机制是多种多样的,如抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,抗氧化和清除氧自由基等。姜黄素对非小细胞肺癌有抑制作用,有研究表明姜黄素可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,诱导其发生周期阻滞或者凋亡,但其具体机制尚不清楚。钙池操纵的Ca2+通道(SOC)广泛存在于细胞膜上,是非兴奋性细胞胞外Ca2+内流的主要通道。1986年James Putney首次提出库容性钙内流(capacitative Ca2+entry, CCE)概念,现在称之为钙池调控钙内流(store-operated calcium entry, SOCE),是指ER中Ca2+浓度下降诱发细胞外Ca2+内流的过程。自这一过程被揭示以来,SOCE几乎在所有细胞中存在,参与细胞的分泌、生长、控制、淋巴细胞激活和免疫等重要功能。随着RNA干扰技术的发展,SOCE过程中两个重要分子被确定：STIMl(Stromal interaction molecule1,基质相互作用因子1)和Orai1。SOCE主要引起外钙内流,SOCE是否在姜黄素诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡中发挥作用,尚未见有报道。因此,本研究主要探讨SOCE是否参与姜黄素诱导非小细胞肺癌细胞凋亡过程,为开发姜黄素作为肿瘤治疗药物提供理论支持。目的探索STIM1和Orai1是否参与姜黄素诱导的非小细胞肺癌A549的凋亡；探索STIM1和Orai1在姜黄素诱导A549细胞凋亡中的机制。方法1.将非小细胞肺癌细胞株A549细胞置于37℃培养箱内培养(5%CO2、95%空气),分别不同浓度的姜黄素处理A549细胞不同时间后,MTT法检测细胞增殖活力。2.细胞铺板24h后,用不同浓度姜黄素处理24h,收集细胞流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。3.荧光定量PCR的方法来检测姜黄素处理后A549细胞上STIM1和Orai1在mRNA水平上的变化。4.免疫印迹法检测不同浓度姜黄素作用对STIM1和Orai1蛋白表达水平的影响。5.通过siRNA干扰的方法下调A549细胞上STIM1和Orai1的表达,并通过免疫印迹的方法来检测siRNA的干扰效率。6.通过转染野生型STIM1质粒和野生型Orai1质粒的方法来过表达STIM1和Orai1,并通过免疫印迹检测野生型STIM1和Orai1质粒的过表达效率。7.流式细胞仪的方法检测STIM1和Orai1干扰和过表达后细胞凋亡率的变化。结果1.姜黄素可诱导A549细胞凋亡不同浓度的姜黄素处理非小细胞肺癌A549细胞12、24、48小时后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活力,结果显示,24小时后细胞的抑制作用明显升高,与对照组比较之间差异具有统计学意义(P<0.01)。不同浓度的姜黄素处理A549细胞24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示,25μmol/L姜黄素处理24小时后细胞凋亡率与对照组比较明显升高并具有统计学意义(P<0.01)。以上结果表明,姜黄素可诱导非小细胞肺癌细胞A549凋亡,并具有剂量和时间反应关系。2.姜黄素对A549细胞STIM1和Orai1mRNA表达的影响姜黄素处理A549细胞24h后发现STIM1和Orai1的mRNA表达水平有明显下降(P<0.01)。3.姜黄素对A549细胞STIM1和Orai1蛋白表达水平的影响不同浓度姜黄素处理A549细胞24h后发现STIM1和Orai1的蛋白表达水平发生下降。4. siRNA干扰STIM1和Orai1后,免疫印迹的方法检测干扰效率,结果显示在A549细胞上,STIM1-siRNA1的干扰效率为57%,STIM1-siRNA2的干扰效率为75%,Orai1-siRNA1的干扰效率为49%,Orai1-siRNA2的干扰效率为50%；STIM1和Orai1干扰后,25μmol/L姜黄素处理A549细胞24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,数据显示干扰后姜黄素处理组与对照组比较细胞凋亡率上升。5.把空质粒、野生型STIM1和Orai1质粒分别转染到非小细胞肺癌A549细胞中,免疫印迹方法检测发现STIM1质粒的转染效率为216%(图10),Orai1质粒的转染效率为154%(图11)；STIM1和Orai1野生型质粒过表达后,25μmol/L姜黄素处理A549细胞24小时,流式细胞仪检测细胞凋亡率,数据显示过表达后姜黄素处理组与对照组比较细胞凋亡率下降。结论1.姜黄素可诱导非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡,并具有剂量和时间反应关系。2.姜黄素处理后导致细胞内STIM1和Orai1的mRNA和蛋白水平表达量下调,姜黄素可能通过抑制STIM1和Orai1的mRNA表达,进一步抑制STIM1和Orai1的蛋白表达,最终导致细胞凋亡。3. STIM1和Orai1干扰后细胞凋亡率上升,STIM1和Orai1过表达后细胞的凋亡率下降,进一步证明STIM1和Orai1通过自身表达量的改变参与姜黄素诱导的非小细胞肺癌A549细胞凋亡。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
前言  14-19
材料和方法  19-33
  1 材料  19-22
  2 方法  22-33
结果  33-52
  1. 姜黄素可诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡  33-37
  2. 姜黄素对A549细胞STIM1和Orai1 mRNA表达的影响  37-38
  3. 姜黄素处理非小细胞肺癌后,STIM1和Orai1表达下降  38-42
  4. 干扰STIM1或Orai1的干扰效率  42-45
  5. STIM1或Orai1干扰后凋亡率的变化  45-47
  6. STIM1或Orai1过表达的表达效率  47-50
  7. STIM1或Orai1过表达后凋亡率的变化  50-52
讨论  52-55
结论  55-57
参考文献  57-61
硕士期间发表论文  61-62
致谢  62-63

Orai1和STIM1在姜黄素诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡中的作用

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