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肺腺癌胸腔积液患者证型及胸水肿瘤细胞生物学特性与之相关性的研究

作　者: 马雪曼
导　师: 张培彤
学　校: 北京中医药大学
专　业: 内科学
关键词: 肺腺癌胸腔积液肿瘤细胞证型血管内皮生长因子 CD133
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：观察肺腺癌胸腔积液患者证型分布情况；通过分离培养胸腔积液中的肿瘤细胞,观察它的生物学特性,如细胞周期、细胞凋亡；并研究胸水中血管内皮生长因子(VBGF)的含量、胸水肿瘤细胞表面肿瘤干细胞标志物CD133的表达量与疾病的临床进展的相关性。方法：(1)实验研究：收集中国中医科学院广安门医院肿瘤科27例肺腺癌胸腔积液患者,无菌闭式引流术收集患者胸腔积液,采用密度梯度离心法对胸水中的肿瘤细胞进行分离收集,并悬浮培养,观察其生长情况,并通过HE染色法结合临床诊断信息对所得细胞进行鉴定；采用Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上分别检测悬浮培养的胸水肿瘤细胞、悬浮培养的人肺腺癌A549细胞、贴壁培养的人肺腺癌A549细胞的细胞凋亡率；用PI染色上流式细胞仪检测贴壁培养的人肺腺癌A549细胞和悬浮培养的胸水肿瘤细胞的细胞周期。(2)临床研究：对60例广安门医院肿瘤科肺腺癌胸腔积液患者进行病例观察和中医证型调查研究表的问卷调查,分析患者的中医证型分布情况；其中27例患者接受无菌闭式引流术抽出胸水,收集患者胸腔积液的上清液,实验采用ELISA法检测这27例胸水中的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度,并研究VEGF浓度与中医证型的关系；用流式细胞术对16例患者的胸水肿瘤细胞进行肿瘤干细胞表面标志物CD133的检测。结果：(1)密度梯度离心法可以分离出胸腔积液中的肿瘤细胞,所得肿瘤细胞能够继续悬浮培养,可传代培养,但生长速度较为缓慢。HE染色后显微镜下观察细胞形态,可见细胞体积较大,细胞形状不均一,细胞核较大,存在巨核,核质比高,细胞核形态多样,可见双核及多核,经病理鉴定为癌细胞；结合患者临床病理诊断,27例患者均为原发性肺腺癌,即确定所悬浮培养的细胞为肺腺癌细胞。(2)凋亡实验中,A549贴壁细胞组总凋亡率(6.12±0.19%)为三组中最低；胸水肿瘤细胞组总凋亡率(11.87±0.11%)>A549贴壁细胞组,有统计学意义(P<0.05)；A549悬浮细胞组总凋亡率(27.17±0.15%)显著高于其他两组,有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞周期实验中,两组细胞处于G0-G1期的细胞含量存在明显差异,中文摘要A549细胞<胸水肿瘤细胞,有统计学意义(P<0.05)；两组细胞处于G2期的细胞含量存在差异,A549细胞>胸水肿瘤细胞,有统计学意义(P<0.05)；两组细胞处于S期的细胞含量存在差异,A549细胞>胸水肿瘤细胞,有统计学意义(P<0.05)。(5)60例患者中医证型情况调查中,单证中气虚证出现频次最多(43例,35.2%),其次出现较多的单证依次为血瘀型(24例,19.7%)、痰湿型(21例,17.2%)、阴虚型(17例,13.9%)。大多数患者为复证,其中主要证型有气阴两虚证(15例,16.9%),气虚血瘀证(11例12.4%),气虚痰湿证(13例,14.6%)。(6)实验采用ELISA法检测27例肺腺癌胸腔积液患者胸水中血管内皮生长因子VEGF的浓度,其浓度在不同患者胸水中波动在4.72pg/m1～1812.09pg/m1范围内,平均值为730.31pg/ml。Ⅲ期患者胸水中VEGF浓度Ⅲ期高于Ⅳ期,但是差异无统计学意义(P>0.05)。气虚血瘀型患者胸水VEGF均值为1425.83pg/m1,与27例患者总计均值比较显著增高,P<0.05,差异具有统计学意义。其他各证型VEGF浓度与总计均值比较无明显差异,P>0.05,无统计学意义(6)流式细胞术检测16例肺腺癌胸腔积液患者的胸水肿瘤细胞表面肿瘤干细胞标志物CD133表达水平,其表达量在1.39%～34.67%范围内。其中只有1例胸水肿瘤细胞表面CD133表达量为34.67%,1例表达量为4.50%,其他14例均为1%～2%之间,无明显表达。结论：(1)密度梯度离心法分离能够分离出胸水中的肿瘤细胞,并且可以继续培养,为保持胸水肿瘤细胞的生物学特性,采用悬浮培养的方法,但生长速度较为缓慢。(2)悬浮培养的胸水肿瘤细胞凋亡率在10%左右,悬浮培养能够为胸水肿瘤细胞提供适宜的生长条件,模拟其在胸腔积液中的环境,说明胸水肿瘤细胞具有抗脱落凋亡的特性。(3)约有90%的胸水肿瘤细胞处于静止期,说明大部分细胞在悬浮状态下细胞周期停滞,增殖活动减少。正因为胸水肿瘤细胞这一特性,使其具备了对化疗药耐药的能力。(4)肺腺癌胸腔积液患者证型主要包括气阴两虚证、气虚痰湿证、气虚血瘀证,大部分患者证型为本虚标实,虚实夹杂,这与疾病中晚期时患者正气虚耗,邪气留滞相关。(5)临床分期与VEGF浓度无明显相关性。气虚血瘀型均值为1425.83pg/ml,与27例患者总计均值比较显著增高,P<0.05,差异具有统计学意义。(6)16例肺腺癌胸腔积液患者胸水肿瘤细胞表面肿瘤干细胞标志物CD133的表达量,其中只有1例胸水肿瘤细胞表面CD133表达量为34.67%,1例表达量为4.50%,其他14例均为1%-2%之间,无明显表达。本研究检测的病例数较少,未能准确全面的反映胸水肿瘤细胞CD133表达量与患者临床信息之间的关系,有待今后进一步扩大病例数进一步深入研究分析。

全文目录

目录  3-4
中文摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩略词表  10-11
文献综述  11-33
  综述一恶性胸腔积液中肿瘤细胞及其相关因子的检测及应用  11-18
  综述二针对胸水肿瘤细胞的恶性胸腔积液中西医治疗进展  18-22
  综述三 CD133作为肿瘤干细胞标志物在肺癌研究中的应用  22-33
第一章实验研究  33-44
  实验一肺腺癌患者胸腔积液中肿瘤细胞的分离富集、鉴定及体外培养  33-37
  实验二肺腺癌胸腔积液患者胸水肿瘤细胞凋亡的研究  37-41
  实验三肺腺癌胸腔积液患者胸水肿瘤细胞周期的研究  41-44
第二章临床研究  44-60
  临床研究一：肺腺癌胸腔积液患者中医证型分布调查  44-50
  临床研究二：肺腺癌胸腔积液患者胸水中血管内皮生长因子(VEGF)的测定  50-56
  临床研究三：肺腺癌胸腔积液患者胸水肿瘤细胞表面干细胞标志物CD133表达量的测定  56-60
附录  60-65
致谢  65-66
个人简介  66

肺腺癌胸腔积液患者证型及胸水肿瘤细胞生物学特性与之相关性的研究

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