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苏木、鸡血藤含药血清对PG细胞增殖影响的机制研究

作　者: 郭秀伟
导　师: 张培彤
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 苏木鸡血藤顺铂细胞周期 P16 Rb1
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

中医学认为,瘀血与癌毒胶结不解,产生癌瘤。《景岳全书》云：“瘀血留滞作癥”,表明血瘀证与肿瘤的产生密切相关。现代医学通过对肿瘤患者血液高凝、高黏状态进行调查研究,发现95%的肿瘤转移患者具有1项或多项实验室检查凝血指标的异常。因此,活血化瘀药在中医界中一直被广泛应用于肿瘤的治疗。苏木、鸡血藤作为活血化瘀药,在临床上广泛用于治疗肺癌等各种恶性肿瘤。近年来有关苏木、鸡血藤的体内外研究表明,其对各种肿瘤均有一定抑制作用。本课题在既往的体内实验中,研究了川芎、鸡血藤、苏木和水蛭四种活血化瘀药对不同阶段Lewis肺癌生长和转移的影响,结果亦表明苏木、鸡血藤的抑瘤及抑制转移的作用显著。在前期体外实验中,通过MTT法检测不同剂量苏木提取液对常氧和低氧培养的高转移人肺巨细胞癌细胞系(PG)增殖的影响,结果发现苏木提取液在常氧和低氧条件下均表现出对PG细胞的增殖抑制作用,而且常氧环境对其增殖的抑制作用较低氧更加明显。首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科的实验也发现,鸡血藤水提物体外对六种肿瘤细胞系(A549, HT229, PG, PANC21, SMMC27721, IEC26)具有抗增殖作用。肺癌是常见的预后较差的恶性肿瘤之一,绝大部分肺癌患者到医院就诊时,已经失去了外科手术和多学科治疗的最佳时机。肺癌治疗方面,化疗是其综合基本措施之一虽然它能杀死肿瘤细胞,但其对处于细胞周期中的非肿瘤细胞也可以损害并杀死,这些细胞主要包括肠上皮细胞、毛囊细胞、造血干细胞,正是由于这些副作用造成的严重后果,化疗的应用受到了很大的限制。因此,寻求新的抗癌药物,提高肺癌患者的生活质量,延长其生存时间,一直是肿瘤治疗领域亟待解决的问题之一。本研究采用了苏木含药血清相关各组(苏木含药血清、苏木含药血清联合顺铂、空白血清、单药顺铂)及鸡血藤含药血清相关各组(鸡血藤含药血清、鸡血藤含药血清联合顺铂、空白血清、单药顺铂)作用于体外培养的人肺癌PG细胞,观察其对PG细胞增殖作用、细胞形态、细胞周期各期比例、细胞周期相关蛋白即细胞周期蛋白D1(CyclinDl)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)、增殖细胞核相关抗原(PCNA)及相关基因即视网膜母细胞瘤基因(Rb)、多肿瘤抑制基因1(P16) mRNA表达量的影响,为苏木、鸡血藤的抗肺癌作用机制提供实验依据。目的探讨苏木、鸡血藤含药血清联合顺铂对人肺癌PG细胞株的增殖抑制作用、周期阻滞作用及其分子机制。方法1制备苏木、鸡血藤含药血清和空白血清,通过MTT法观察苏木、鸡血藤含药血清联合顺铂对PG细胞增殖的抑制作用。2采用光镜和激光共聚焦显微镜观察空白组、苏木组、苏木+顺铂组和顺铂组及其空白组、鸡血藤组、鸡血藤+顺铂组和顺铂组对PG细胞形态的影响。3流式细胞仪检测各组的细胞周期4激光共聚焦显微镜观察各组血清对PG细胞Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达的影响。5PCR法检测各组血清对PG细胞p16、Rbl基因mRNA表达的影响。结果1苏木相关各含药血清组均在药物干预24h后出现抑制作用,并且具有时间和剂量依赖性。与苏木组比较,苏木+顺铂组和顺铂组抑制作用显著。苏木+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义2光镜和激光共聚焦显微镜下苏木组细胞的胞核浓缩呈半月形、胞质浓缩深染程度明显,但低于顺铂组和苏木+顺铂组,苏木+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义。3与空白组比较,苏木组PG细胞的G0/G1和s期比例增加,G2/M期降低；顺铂组和苏木+顺铂组的s和G2/M期比例增加,G0/G1期降低,较苏木组的s期和G2/M期比例增加,G0/G1期降低。苏木+顺铂组PG细胞的各期较顺铂组差异无统计学意义4苏木组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达较空白组降低,顺铂组和苏木+顺铂组亦降低且比苏木组降低幅度更明显；与顺铂组比较,苏木+顺铂组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达降低但差异无统计学意义。5苏木组P16和Rb1mRNA的表达较空白组增加,顺铂组和苏木+顺铂组亦增加且优于苏木组；与顺铂组比较,苏木+顺铂组P16和Rb1mRNA的表达差异无统计学意义。6鸡血藤相关各含药血清组均在药物干预24h后出现抑制作用,并且具有时间和剂量依赖性。与鸡血藤组比较,鸡血藤+顺铂组和顺铂组抑制作用显著。鸡血藤+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义。7光镜和激光共聚焦显微镜下鸡血藤组细胞的胞核浓缩呈半月形、胞质浓缩深染程度明显,但低于顺铂组和鸡血藤+顺铂组,鸡血藤+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义。8与空白组比较,鸡血藤组PG细胞的G2/M比例显著增加,G0/G1和s期降低,但无统计学意义；顺铂组和鸡血藤+顺铂组的s和G2/M期比例显著增加,G0/G1期降低,较鸡血藤组的s期和G2/M期比例显著增加,G0/G1期显著降低。鸡血藤+顺铂组PG细胞的各期比例较顺铂组差异无统计学意义。9鸡血藤组较空白组Cyc1inD1、CDK4蛋白表达无明显差异,PCNA蛋白表达减少,顺铂组和鸡血藤+顺铂组较空白组和鸡血藤组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达均降低；与顺铂组比较,鸡血藤+顺铂组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达降低但差异无统计学意义。10鸡血藤组P16和RblmRNA的表达较空白组无明显差异,顺铂组和鸡血藤+顺铂组较空白组和鸡血藤组增加；与顺铂组比较,鸡血藤+顺铂组P16和RblmRNA的表达差异无统计学意义。结论苏木含药血清具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用通过下调CyclinDl、CDK4、PCNA蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平从而引起PG细胞GO/G1、S期阻滞而发挥作用的。这与顺铂通过cyclinBl使细胞停滞在G2/M、S期不同。顺铂亦可通过下调CyclinDl、CDK4、PCNA蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平对细胞周期产生影响。苏木未能协同顺铂发挥对PG细胞的增殖抑制作用,从实验操作角度考虑,顺铂为体外添加的直接作用于PG细胞的细胞毒药物,其细胞增殖抑制作用较强,由于添加顺铂时可能在剂量方面出现误差,从而掩盖了苏木的抑制增殖作用。从体内实验考虑,前期试验中,分7、14、21天3个时间点动态观察苏木对C57BL小鼠肺癌瘤重的影响,结果发现同一时间点各组的抑瘤率由低到高依次为苏木低剂量、苏木高剂量组、化疗组、化疗加苏木低剂量组、化疗加苏木高剂量组,其中化疗加苏木高剂量组的瘤重低于同期化疗组,而化疗加苏木低剂量组的瘤重与同期化疗组比较无统计学意义,分析其原因可能是1.本实验中苏木组既然可以发挥抑癌效果,苏木理应可以协同顺铂的作用,分析其原因可能是体外添加顺铂引起的实验误差使得苏木并未表现出增效效果的原因占主要地位；2.中药苏木并未直接增强化疗药顺铂的增殖抑制作用,虽然在体内试验中体现出了这种作用,可是体内试验的微环境与体外实验不同,体内试验中可能是苏木通过其他靶点、途径间接发挥抑瘤作用,如中药可以通过减缓胃肠道反应、改善骨髓抑制、减轻免疫抑制、防止多器官功能损伤而发挥抑瘤作用。3.中药与化疗药联合应用并不能使抗肿瘤作用加强,无增效作用,也不会使抗肿瘤作用减弱,无减效作用。鸡血藤含药血清具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用并未通过下调CyclinDl、CDK4蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平从而引起PG细胞GO/G1、S期阻滞而发挥作用的,而是通过下调PCNA蛋白表达,间接引起PG细胞G2/M期阻滞。这与顺铂通过cyclinBl使细胞停滞在G2/M、S期不同。顺铂亦可通过下调CyclinDl、CDK4、PCNA蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平对细胞周期产生影响。鸡血藤未能协同顺铂发挥对PG细胞的增殖抑制作用,从实验操作角度考虑,顺铂为体外添加的直接作用于PG细胞的细胞毒药物,其细胞增殖抑制作用较强,由于添加顺铂时可能在剂量方面出现误差,从而掩盖了鸡血藤的抑制增殖作用。从体内研究考虑,富琦等采用小鼠移植性Lewis肺癌模型,观察鸡血藤SSCE体内的抑瘤效应,结果发现,化疗与中药联合应用并不能使抗肿瘤作用加强,无增效作用。这就从体内角度说明鸡血藤不能协同顺铂发挥增效作用的原因。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
英文缩略词表  13-14
文献综述  14-22
  参考文献  19-22
前言  22-24
第一章含药血清的制备  24-28
  1 材料  24
  2 方法  24-25
  3 结果  25-26
  4 讨论  26-28
第二章苏木含药血清对PG细胞增殖作用的影响  28-36
  1 材料  28
  2 方法  28-30
  3 统计分析方法  30
  4 结果  30-34
  5 讨论  34-36
第三章苏木含药血清对PG细胞形态的影响  36-40
  1 材料  36
  2 实验方法  36-37
  3 结果  37-38
  4 讨论  38-40
第四章苏木含药血清对PG细胞周期的影响  40-44
  1 材料  40
  2 方法  40-41
  3 统计分析方法  41
  4 结果  41-42
  5 讨论  42-44
第五章苏木含药血清对PG细胞CYCLIND1、CDK4、PCNA蛋白表达的影响  44-51
  1 材料  44-45
  2 方法  45-46
  3 统计分析方法  46
  4 结果  46
  5 讨论  46-51
第六章苏木含药血清对PG细胞P16、RB1MRNA表达的影响  51-59
  1 材料  51-52
  2 方法  52-55
  3 统计分析方法  55
  4 结果  55-57
  5 讨论  57-59
第七章鸡血藤含药血清对PG细胞增殖作用的影响  59-65
  1 材料  59
  2 方法  59
  3 统计分析方法  59
  4 结果  59-63
  5 讨论  63-65
第八章鸡血藤含药血清对PG细胞形态的影响  65-68
  1 材料  65
  2 实验方法  65
  3 结果  65-66
  4 讨论  66-68
第九章鸡血藤含药血清对PG细胞周期的影响  68-71
  1 材料  68
  2 方法  68
  3 统计分析方法  68
  4 结果  68-69
  5 讨论  69-71
第十章鸡血藤含药血清对PG细胞CYCLIND1、CDK4、PCNA蛋白表达的影响  71-76
  1 材料  71
  2 方法  71
  3 统计分析方法  71
  4 结果  71
  5 讨论  71-76
第十一章鸡血藤含药血清对PG细胞P16、RB1MRNA表达的影响  76-79
  1 材料  76
  2 方法  76
  3 统计分析方法  76
  4 结果  76-78
  5 讨论  78-79
结语  79-87
  1 主要研究结果  79-81
  2 讨论  81-85
  3 存在问题与展望  85-87
参考文献  87-91
致谢  91-92
个人简历  92

苏木、鸡血藤含药血清对PG细胞增殖影响的机制研究

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