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PGI基因对白血病的影响和机制的研究及Rh2对白血病影响的机制和抑制PGI的关系

作　者: 赵亮
导　师: 陈地龙
学　校: 重庆医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: PGI /AMF RNA 干扰糖酵解途径 PI3K-Akt 信号通路 Rh2
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景及目的白血病是高发的造血系统恶性肿瘤。其特点为正常造血细胞受到某一类型的白血病细胞的抑制，骨髓或其他造血组织中白血病细胞恶性增生，浸润体内各组织脏器，产生各种临床症状。治疗以化疗、骨髓移植为主，某些类型白血病化疗耐药，治疗效果差，预后较差。磷酸葡萄糖异构酶（phosphoglucose isomerase，PGI）作为一种多功能蛋白广泛存在于各种组织中，在细胞内是催化糖酵解和糖异生途径葡萄糖-6-磷酸酶与果糖-6-磷酸酶之间的相互转化的一种关键酶[1]。因为能被细胞分泌到胞外作用于周围细胞发挥各种作用被称作自分泌活动因子（autocrine motility factors，AMF）[2-4]。它的激活促进肿瘤细胞的生长、侵润、转移的活性。我们的前期研究表明，用人参多糖GPS作用于白血病细胞，其PGI基因能被明显的抑制[5]。为研究下调PGI后与白血病的发生发展的关系，我们构建了共表达荧光蛋白和人PGI基因siRNA的慢病毒质粒，转染高表达PGI基因的人白血病细胞,初步观察RNA干扰PGI基因对白血病细胞生物学特性的影响及其可能的机制，同时加入人参皂苷单体Rh2，观察其对白血病细胞的作用与抑制PGI的关系方法第一部分提取并收集人正常单核细胞，收集白血病细胞K562、KG1-α、HL60细胞，RT-PCR、 Western Blot检测PGI在人单核细胞及白血病细胞中的表达情况，筛选出高表达PGI的白血病细胞。构建表达特异干扰PGI基因siRNA的慢病毒质粒和阴性对照质粒，利用表达PGI siRNA的慢病毒质粒转染高表达PGI的白血病细胞，RT-PCR、Western Blot检测该白血病细胞中PGI的表达。第二部分利用cck-8检测RNA干扰白血病细胞PGI基因后细胞的增殖情况，流式细胞仪检测RNA干扰白血病细胞PGI基因后细胞的周期分布和凋亡情况。Elisa检测干扰后细胞外液PGI含量。Western blot检测干扰后糖酵解途径HK2、PGI、LDHA、PKM2的蛋白表达；Western blot检测干扰后AMF下游PI3K-Akt途径PI3K、Akt、cyclinD1、caspase-3的蛋白表达。第三部分用己糖激酶抑制剂3-BrPA和人参皂苷单体Rh2处理高表达PGI基因的白血病细胞，人参皂苷单体Rh2处理干扰后KG1-α细胞，Westernblot检测糖酵解途径HK2、PGI、LDHA、PKM2的蛋白表达；Westernblot检测AMF下游PI3K-Akt途径PI3K、Akt、cyclinD1、caspase-3的蛋白表达，观察Rh2是否通过PGI发挥作用。实验结果1、白血病细胞中PGI的mRNA和蛋白表达量明显高于人单核细胞，其中以KG1-α细胞表达量最高。2、成功构建表达PGI siRNA的慢病毒质粒，转染重组质粒后能使白血病细胞系KG1-α的PGI基因的mRNA及蛋白表达水平下调。干扰组PGI mRNA的抑制率为55.4%，与阴性对照组比较，有明显差异(P<0.01)；干扰组PGI蛋白的抑制率为83.1%，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P <0.01)。3、CCK8检测KG1-α细胞增殖：白血病细胞在第5天出现增殖高峰。干扰组细胞增殖能力明显低于阴性对照组。(P﹤0.01)4、流式细胞术检测细胞周期：干扰组增殖指数为40.48±0.59％，明显低于阴性对照组60.65±0.62％和空白对照组56.61±0.68％。(P﹤0.05)5、流式细胞术检测细胞凋亡：干扰组细胞凋亡率23.00±0.65%，明显高于阴性对照组3.94±0.48%和空白对照组4.92±0.33%。6、Elisa检测干扰后细胞外液PGI含量明显降低。7、western blot检测干扰PGI后糖酵解途径及PI3K/Akt途径受到抑制。8、western blot检测Rh2作用后糖酵解途径及PI3K/Akt途径均受到抑制。结论1、PGI在白血病细胞中高表达，其中以KG1-α细胞表达量最高。2、成功构建了人PGI慢病毒质粒并感染人白血病细胞系KG1-α，发现能有效抑制KG1-α细胞PGI基因mRNA和蛋白的表达。下调白血病细胞KG1-α中PGI的表达能降低细胞的增殖能力,能影响将细胞周期阻滞在G0/G1期，增加细胞凋亡。4、下调PGI基因后能抑制细胞的糖酵解途径。5、下调PGI基因后能抑制细胞自分泌PGI/AMF，并抑制下游PI3K-Akt信号通路。6、人参皂苷单体Rh2对白血病细胞KG1-α的影响机制除可以通过Wnt/βcatenin信号通路外还可以通过抑制PGI从而影响糖酵解途径和PI3K-Akt途径。

全文目录

符号说明  6-8
摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
前言  17-19
第一部分 PGI 基因在白血病细胞中的表达及 PGI SiRNA 慢病毒质粒的构建及转染  19-40
  1 材料与方法  19-28
  2 统计学分析  28
  3 实验结果  28-32
  4 讨论  32-33
  结论  33-34
  参考文献  34-36
  第一部分图片  36-40
第二部分 RNA干扰下调PGI表达后对白血病KG1-α细胞凋亡及周期的影响及机制的研究  40-57
  1 材料与方法  40-43
  2 统计学分析  43-44
  3 实验结果  44-48
  4 讨论  48-50
  结论  50-51
  参考文献  51-55
  第二部分图片  55-57
第三部分人参皂苷单体 Rh2 对 KG1-α细胞的增殖抑制的机制与抑制 PGI 表达的关系  57-70
  1 材料与方法  57-59
  2 统计学分析  59-60
  3 实验结果  60-62
  4 讨论  62-64
  结论  64-65
  参考文献  65-68
  第三部分图片  68-70
文献综述  70-82
  参考文献  76-82
致谢  82-83
硕士期间发表的论文  83-84

PGI基因对白血病的影响和机制的研究及Rh2对白血病影响的机制和抑制PGI的关系

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