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三种升麻三萜皂苷类化合物对白血病干细胞Wnt/β-catenin信号通路自我更新机制的初步研究
作 者: 陈冲
导 师: 徐瑞荣
学 校: 山东中医药大学
专 业: 中西医结合临床
关键词: 升麻 三萜皂苷类化合物 自我更新 Wnt β-catenin 信号通路
分类号: R733.71
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
目的:本研究选取三种升麻三萜皂苷类化合物(triterpene glycosides fromCimicifuga foetida)Compound4、5、10(以下简称A、DA、KCY4),通过影响Wnt/β-catenin自我更新信号通路的两个关键因子APC和Cyclin D1,探讨二者对β-catenin蛋白功能的的调节作用,为药物靶向用于急性髓细胞性白血病的治疗寻求实验学支持,以期为提高白血病的临床疗效提供新的思路和方法。方法:1.体外实验:(1)培养急性髓性白血病KG-1a细胞株,MidiMACS方法从KG-1a细胞系中分选CD34~+/CD123~+表达的白血病干细胞(leukemia Cem cells,LSCs),流式检测细胞纯度为98%以上,将分离得到的细胞静置培养。(2)CCK-8法检测不同浓度、不同时间点A、DA、KCY4分别对分选细胞体外生长的抑制作用,由此确定各组的IC50值。(3)流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率;PI染色方法FCM检测细胞周期分布情况。(4)Western-blot检测各用药组的β-catenin、APC、CyclinD1蛋白表达水平。(5)RT-PCR检测各用药组的的β-catenin、APC、CyclinD1的mRNA表达。2.体内实验:(1)以急性髓性白血病KG-1a细胞株建立NOD/SCID小鼠为研究平台,应用A、DA、KCY4进行药物干预。(2)观察小鼠的生存状态,濒死小鼠组织行病理学检查,对各组小鼠的骨髓进行染色体核型分析。(3)给药3周后处死小鼠,取脾细胞悬液采用流式细胞术检测细胞凋亡率及分析细胞周期改变,免疫组化检测淋巴结β-catenin、APC、CyclinD1蛋白的表达改变。结果:1.体外实验:(1)CCK-8法示A、DA、KCY4对LSCs具有生长的抑制作用,呈浓度、时间相关性。A、DA、KCY4作用LSCs48h的IC50分别为0.33μg/mL、0.61μg/mL、7.08μg/mL。因此我们选取中剂量浓度进行试验,A、DA、KCY4浓度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、5μg/mL(低于IC50值)。(2)作用48h后,三组LSCs细胞凋亡率及G1期的停滞率均明显高于对照组,细胞对KCY4较其他两种化合物更为敏感,差异具有统计学意义。(3)Western-blot法检测蛋白在细胞膜上的表达,结果表明,A、DA、KCY4与对照组比较可出现LSCs的APC蛋白表达增加,同时CyclinD1、β-catenin表达减少,有显著性差异。结果显示APC蛋白表达与β-catenin表达呈显著负相关(r=-0.896);CyclinD1蛋白表达与β-catenin表达呈显著正相关(r=0.92)。(4)RT-PCR法检测基因表达,三种化合物基因表达结果与Western-blot蛋白表达结果改变相同,提示这三种化合物可能通过基因转录水平影响蛋白表达。2.体内实验:建立KG-1a/NOD-SCID小鼠模型,A、DA、KCY4能明显延长白血病模型小鼠的生存时间(P<0.01),结果发现三组化合物CyclinD1及β-catenin蛋白表达均低于对照组,APC蛋白表达均较对照组增高,与体内试验结果一致。KCY4在体内的作用机制优于其他两组化合物。结论:我们选取的三种新三萜皂苷类化合物在体内和体外实验研究中表现出不同程度的抗癌活性,为其作为肿瘤治疗作用的靶点提供实验理论依据,其中以KCY4效果最好。
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全文目录
提要 3-5 Abstract 5-10 引言 10-11 第一部分 升麻三萜皂苷化合物 A、DA、KCY4 调节白血病干细胞Wnt/β-catenin 信号通路自我更新途径的体外研究 11-25 1 实验材料 11-13 1.1 细胞株 11 1.2 实验材料 11-13 2 实验方法 13-18 2.1 细胞培养 13 2.2 实验药品 13 2.3 MACS 分选 LSCs 13-14 2.4 CD34~+/CD123~+双阳 LSCs 细胞的培养 14 2.5 生长抑制试验 14 2.6 CCK-8 法检测细胞活性 14 2.7 流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期分布 14-15 2.8 Western-blotting 检测蛋白在细胞膜上的表达 15-16 2.9 荧光定量 PCR 检测 mRNA 表达改变 16-18 3 实验结果 18-25 3.1 细胞分子表面标记 FACS 检测细胞纯度 18 3.2 CCK-8 法检测细胞活性 18-21 3.3 细胞凋亡率检测 21-23 3.4 Western-blotting 检测蛋白的表达水平改变及相关性 23-24 3.5 RT-PCR 法检测β-catenin、CyclinD1 及 APC 的 mRNA 表达水平 24-25 第二部分 升麻三萜皂苷化合物 A、DA、KCY4 调节白血病干细胞Wnt/β-catenin 信号通路自我更新途径的体内研究 25-36 实验一 KG-1a/NOD-SCID 小鼠动物模型的建立及鉴定 25-30 1 实验材料 25-26 1.1 实验细胞及动物 25 1.2 病理试剂、实验器械及耗材 25 1.3 主要仪器和设备 25-26 2 实验方法 26-28 2.1 细胞培养 26 2.2 动物分组及 KG-1a 细胞接种 26-27 2.3 观察小鼠的一般情况及生存时间 27 2.4 外周血白细胞计数及血涂片检测 27 2.5 骨髓涂片 27 2.6 骨髓染色体核型分析 27-28 2.7 病理组织学检查 28 3 实验结果 28-30 3.1 一般情况 28-29 3.2 外周血细胞计数及涂片镜检 29 3.3 骨髓细胞学检查 29 3.4 染色体分析 29 3.5 组织病理学检查 29-30 实验二 升麻三萜皂苷化合物 A、DA、KCY4 对 KG-1a/NOD-SCID 小鼠生存时间、细胞凋亡及周期及 Wnt/β-catenin 信号通路自我更新途径调控因子表达的影响 30-36 1 实验材料 30 2 实验方法 30-32 2.1 实验药物 30 2.2 药物干预 30 2.3 一般情况及生存时间 30-31 2.4 流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期分布 31 2.5 免疫组化检测 31-32 2.6 统计学方法 32 3 实验结果 32-36 第三部分 讨论 36-49 1 中医学对 AML 的认识 36-37 1.1 病因 36 1.2 病机 36 1.3 治疗原则 36-37 2 白血病干细胞 37-40 2.1 白血病干细胞 37-39 2.2 自我更新机制与白血病 39-40 3 Wnt 信号通路细胞信号转导与白血病 40-44 3.1 白血病信号转导与自我更新机制 40 3.2 Wnt 的自我更新作用机制 40-41 3.3 关键效应蛋白β-catenin 的调节 41-42 3.4 靶基因的调控 42 3.5 细胞凋亡率和细胞周期与 Wnt 信号通路 42-44 4 NOD/SCID 鼠 44 5 药物分析 44-46 5.1 升麻提取物及药理作用 45 5.2 本研究选取的升麻三萜皂苷类化合物的研究背景 45-46 6 实验结果的讨论 46-49 6.1 三种新分离的升麻三萜皂苷类化合物 A、DA、KCY4 体外试验 46-47 6.2 三种新分离的升麻三萜皂苷类化合物 A、DA、KCY4 对 KG-1a/NOD-SCID 的体内试验 47-49 结语 49-50 参考文献 50-56 综述 56-63 参考文献 60-63 附录 63-73 致谢 73-74 攻读学位期间发表的学术论文目录及科研参与情况 74-75 发表的论文 75-80 详细摘要 80-88
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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