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Netrin4和Neogenin在成纤维肉瘤细胞HT1080中的作用及其机制探讨

作　者: 贾茵
导　师: 袁立
学　校: 厦门大学
专　业: 细胞生物学
关键词: NTN4 NEO HT1080 肿瘤生长与转移
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


Netrin-4(NTN4)是神经导向因子Netrins家族在脊椎动物中的新成员,具有导向神经轴突生长的功能。它不仅在神经系统中起作用,同时在多种组织器官中发挥生物学功能。近年来的研究发现,NTN4在肿瘤发生发展中也发挥着重要的调控作用,但目前对NTN4在肿瘤发生发展中的作用仍然存在争议：有研究证明NTN4抑制肿瘤发生发展,也有研究证明它促进肿瘤发生发展。并且,就目前已有研究看,对于NTN4在肿瘤侵袭转移过程中作用的报道很少,大多集中在对肿瘤生长和血管新生的研究。Neogenin (NEO)是神经导向因子家族受体中NTN4的候选受体,在多种肿瘤组织中低表达,目前关于NTN4的功能是否受NEO介导仍然存在争议。且目前为止,没有在肿瘤细胞上关于NTN4与NEO相互作用的研究。因此,它们的相互作用仍有待进一步研究。本论文旨在研究NTN4和NEO在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用,并进一步研究和探讨NEO是否介导NTN4的体外功能。HT1080是高转移性的人成纤维肉瘤细胞系,是研究肿瘤侵袭转移的理想模型。我们的研究发现NTN4和NEO在HT1080细胞中都有相对较高的表达。所以,本课题首先通过RNAi技术分别建立NTN4和NEO基因敲低细胞系,研究在体外NTN4及NEO对HT1080细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。其次,体内实验采用斑马鱼肿瘤外植体模型研究HT1080-NTN4和HT1080-NEO敲低细胞系在生物体内转移能力。研究发现敲低NTN4基因的HT1080细胞增殖能力增强,迁移和侵袭能力降低,MMP-9表达量降低,MMP-2无明显变化。而敲低NEO基因的HT1080细胞增殖能力降低,迁移和侵袭能力增强,MMP-2和MMP-9表达量升高。同样,体内转移结果与体外一致。然而在对NEO是否介导NTN4的体外功能的初步研究中,我们发现细胞中添加外源NTN4蛋白可抑制细胞增殖,促进细胞迁移和侵袭,但在敲低NEO后的细胞中再添加等浓度NTN4蛋白,这种抑制增殖和促进迁移和侵袭的作用表现的更为显著,且与只敲低NEO的细胞系相比也更明显。这又说明,在体外NTN4确实有抑制HT1080细胞增殖和促进迁移侵袭的作用,且此作用可能受NEO的介导。此外,在对一些与肿瘤生长以及侵袭转移相关蛋白的检测中发现,HT1080细胞敲低NTN4后Vimentin和P-ERK1/2表达降低,P-p38表达增强；而敲低NEO后则导致Vimentin和P-ERK1/2表达增强,P-p38表达无显著变化。以上研究表明,在HT1080细胞中NTN4可促进细胞的迁移和侵袭,但抑制细胞增殖。而NEO可抑制细胞迁移和侵袭,但促进细胞增殖。至少在HT1080细胞中,二者具有各自的作用和胞内信号传导通路。此外,虽然在HT1080细胞上它们也存在配受体的关系,但这种关系在许多方面也许并不重要。同样,NTN4和NEO还可能分别存在各自的受配体。究竟在什么情况下出现这种现象,以及在如HT1080细胞类型的其他细胞中有关NTN4和NEO相互作用的详细分子机制,还值得进一步研究。

全文目录


目录  4-6
CONTENTS  6-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
前言  12-21
  1.1 神经导向因子Netrins家族简介  12-14
  1.2 NTN4和NEO基因的结构  14-15
  1.3 NTN4和NEO基因的功能  15-16
  1.4 NTN4和NEO对肿瘤生长和侵袭转移的功能  16-18
  1.5 NTN4和NEO相互作用的研究  18-19
  1.6 基质金属蛋白酶家族(MMPs)简介  19-20
  1.7 本研究的内容和意义  20-21
实验材料与仪器设备  21-27
  2.1 材料与试剂  21-23
  2.2 主要仪器  23-24
  2.3 试剂配方  24-27
实验方法  27-39
  3.1 NTN4及NEO干扰载体构建  27-29
  3.2 病毒的包装、浓缩与滴定  29-31
  3.3 免疫印迹(Western Blot)  31-32
  3.4 Real-time PCR技术  32-34
  3.5 Elisa测定法  34-35
  3.6 细胞增殖、迁移和侵袭实验  35-36
  3.7 明胶酶谱实验  36-37
  3.8 MMP蛋白质芯片实验  37
  3.9 斑马鱼肿瘤外植体实验  37-39
结果与分析  39-58
  4.1 NTN4和NEO基因在肿瘤细胞中的表达  39-40
  4.2 NTN4和NEO基因敲低细胞系的建立  40-43
  4.3 NTN4对细胞增殖、迁移和侵袭的影响  43-48
  4.4 NEO对细胞增殖、迁移和侵袭的影响  48-51
  4.5 NEO介导NTN4对细胞增殖、迁移和侵袭的作用  51-54
  4.6 斑马鱼体内注射肿瘤细胞转移实验(斑马鱼肿瘤外植体实验)  54-56
  4.7 肿瘤细胞侵袭转移相关蛋白检测  56-58
讨论  58-62
参考文献  62-70
致谢  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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