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ZNF300激活TRAF2介导的NF-kB信号通路促进肿瘤细胞生长

作　者: 汪显国
导　师: 李文鑫
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: ZNF300 Hela细胞增殖 TRAF2 NF-κB 肿瘤生长和转移
分类号: R73-3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

锌指基因家族是人类基因组中最大的基因家族之一,它与细胞分化、胚胎发育以及许多病理现象有着密切的联系。C2H2类锌指基因约占整个锌指基因家族的三分之一。研究表明,许多C2H2类锌指蛋白作为转录因子参与人体的生理病理过程。但是,仍然还有很多C2H2类锌指蛋白的功能未知,有待揭示。ZNF300是本实验室从3到5周龄人早期胚胎cDNA文库中克隆得到的一个典型的KRAB类锌指基因,位于第五号染色体长臂末端5q33.1。前期的研究证实,ZNF300是一种核质共定位蛋白,其入核信号位于C端的锌指区,N端则具有典型的KRAB功能结构域,由此可见ZNF300可能是一个典型的转录因子。体外实验发现ZNF300能够结合到某些含有C(t/a)GGGGG(g/c)G序列的DNA上,该序列存在于某些基因的启动子区,如IL-2, IL2RB, CD44, p53, TNF-a, TRAF2的启动子区,而这些基因大多与细胞的增殖、分化以及凋亡密切相关。临床病例的免疫组化结果表明,ZNF300在肿瘤组织和癌旁组织的表达量明显高于正常组织。进一步的细胞功能研究发现,在促炎症因子TNF-a和LPS的刺激下,Hela细胞中的ZNF300表达量明显上升。增强ZNF300的表达量能够促进Hela细胞生长,而反义ZNF300抑制其表达则减缓Hela细胞生长。基于上述的研究基础,本课题探讨了ZNF300作为转录因子调节细胞生长的作用机制和在体内环境下ZNF300对肿瘤生长的调控作用。通过筛选真核生物启动子数据库,结果发现在TRAF2基因启动子区含有潜在的ZNF300结合靶位点(TTGGGGG,-19bp～-27bp)。由于TRAF2是调控NF-κB信号通路的蛋白因子之一,而NF-κB信号通路与细胞的增殖密切相关,所以推测ZNF300可能通过调控TRAF2和它下游的NF-κB信号通路来影响细胞的增殖。本研究以Hela细胞为模式细胞,利用瞬时转染的方法,增强或抑制ZNF300的表达来研究ZNF300对TRAF2基因的表达调控。RT-PCR和Western-blot的实验结果显示,增强ZNF300的表达能促进TRAF2的表达,而反义ZNF300抑制其表达则降低TRAF2的表达。随后的双荧光素酶报告实验结果表明增强表达ZNF300能够激活TRAF2下游的NF-κB信号通路。为了揭示ZNF300对TRAF2基因的调控机制,首先,利用PCR方法克隆得到TRAF2基因的启动子片段,并对其进行截断或定点突变。双荧光素酶报告实验结果显示ZNF300能够激活TRAF2的启动子,而TRAF2启动子区ZNF300结合位点的缺失或突变都明显的影响ZNF300对TRAF2基因启动子的激活。最后,凝胶迁移率变化实验(EMSA)与染色质免疫共沉实验(CHIP)分别从体外和体内证实了ZNF300与TRAF2基因启动子的直接结合。以上结果表明,ZNF300通过与TRAF2基因启动子直接结合,促进TRAF2的表达,同时激活TRAF2下游的NF-κB信号通路,促进Hela细胞的增殖。在细胞水平已经证实ZNF300调节细胞的增殖是通过调控TRAF2介导的NF-κB信号通路来实现。为了进一步探讨在动物体内ZNF300对肿瘤生长的影响,本研究选择裸鼠为实验模型动物。首先,利用Hela细胞构建ZNF300过表达的稳转细胞系(ZNF300)和反义ZNF300的稳转细胞系(AS-ZNF300),通过皮下接种的方式接种到裸鼠体内,同时接种表达GFP的稳转细胞系(GFP)作阴性对照和生理盐水作空白对照。观察各组裸鼠体内的肿瘤的形成时间、生长和转移状况。结果发现,ZNF300组裸鼠在第7天时出现肿瘤,GFP组裸鼠在第10天时出现肿瘤,AS-ZNF300组则在13天时出现肿瘤。且在20天时,ZNF300组的成瘤率达到100%,GFP组为70%,而AS-ZNF300组为50%。由此可见,过表达ZNF300能促进肿瘤的形成,而抑制ZNF300的表达则延缓肿瘤的形成。同时还发现,在30天时,ZNF300组肿瘤的平均体积是GFP组和AS-ZNF300组的3倍。IL-6和IL-8是NF-κB信号通路的靶标基因,它们在肿瘤细胞逃避免疫机制以及促进肿瘤细胞迁移的过程中有重要作用。本实验通过ELISA检测了IL-6和IL-8在血液中的浓度,结果显示Hela-ZNF300组裸鼠的血液中IL-6和IL-8的含量为GFP对照组的2-3倍,而AS-ZNF300组仅为GFP对照组的一半左右。免疫组化和HE染色的结果表明,在裸鼠体内过表达ZNF300对肿瘤的生长不仅有促进作用,而且伴随着肿瘤细胞的转移。综上所述,本研究探讨了ZNF300调控肿瘤细胞增殖的作用机制和在体内环境下ZNF300对肿瘤生长的调控作用。在体外培养细胞情况下,ZNF300的高表达能够激活TRAF2基因,并激活TRAF2下游的NF-κB信号通路,从而促进肿瘤细胞生长。另外,在动物体内环境下,ZNF300的过表达能够促进肿瘤的生长和转移。因此,我们认为,ZNF300体外促进肿瘤细胞的增殖和体内促进肿瘤发生和转移是通过调节TRAF2介导的NF-κB信号通路来实现的。同时,由于ZNF300能被促炎症因子TNF-a和LPS诱导表达,所以我们也认为ZNF300可能是一个潜在的癌基因,且在炎症与肿瘤的发生过程中担当着重要角色。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-12
中英文缩略对照表  12-18
第一章锌指蛋白概述以及ZNF300研究进展  18-31
  1.1 前言  18
  1.2 锌指蛋白的简介以及分类  18-20
  1.3 锌指蛋白的功能及其作用方式  20-24
    1.3.1 锌指蛋白与胚胎发育  20
    13.2 锌指蛋白与疾病  20-21
    1.3.3 锌指蛋白参与细胞增殖、分化和凋亡的调节  21-22
    1.3.4 锌指蛋白的作用方式  22-24
      1.3.4.1 锌指蛋白与DNA相互作用  22-23
      1.3.4.2 锌指蛋白与RNA的相互作用  23
      1.3.4.3 锌指蛋白与蛋白的相互作用  23-24
      1.3.4.4 锌指蛋白与脂质体相互作用  24
  1.4 KRAB类锌指蛋白简介  24-26
  1.5 ZNF300的研究进展  26-30
    1.5.1 ZNF300的发现  26
    1.5.2 ZNF300基因的结构特征  26-27
    1.5.3 ZNF300的表达谱  27-28
    1.5.4 ZNF300的上下游调控基因  28
    1.5.5 ZNF300的功能研究进展  28-30
      1.5.5.1 ZNF300与细胞增殖  28-29
      1.5.5.2 ZNF300的转录因子活性  29
      1.5.5.3 ZNF300与疾病  29-30
  1.6 小结  30-31
第二章 TRAF2研究进展  31-42
  2.1 TRAF2结构与功能  31-32
  2.2 TRAF2与NF-KB  32-34
  2.3 TRAF2与MAPK信号通路  34-35
  2.4 TRAF2的调节  35-36
  2.5 与TRAF2相互作用的受体及其信号通路  36-40
    2.5.1 TNFR1  36-38
    2.5.2 TNFR2  38
    2.5.3 CD40  38-39
    2.5.4 TACI和BCMA  39
    2.5.5 TRAF2与其它受体的相互作用  39-40
  2.6 TRAF2与疾病  40-41
    2.6.1 TRAF2与癌症  40-41
    2.6.2 TRAF2与炎症  41
    2.6.3 TRAF2和其它疾病  41
  2.7 小结  41-42
第三章 ZNF300调控Hela细胞增殖机制的初步研究  42-65
  摘要  42
  3.1 前言  42-43
  3.2 实验材料和仪器  43-48
    3.2.1 细胞系  43
    3.2.2 载体  43
    3.2.3 试剂盒和酶  43-44
    3.2.4 试剂及溶液的配制  44-47
    3.2.5 实验仪器  47
    3.2.6 分子生物学软件  47-48
  3.3 实验方法  48-60
    3.3.1 表达载体的构建  48-53
    3.3.2 细胞培养及瞬时转染  53-55
    3.3.3 半定量PCR和Western blot  55-59
    3.3.4 双荧光素酶报告实验  59-60
  3.4 实验结果  60-63
    3.4.1 过表达ZNF300和反义ZNF300表达质粒载体的构建和鉴定  60-61
    3.4.2 RT-PCR检测ZNF30对TRAF2的表达影响  61-62
    3.4.3 Western blot检测ZNF300对TRAF2的表达影响  62
    3.4.4 过表达ZNF300对NF-κB结合活性的影响  62-63
  3.5 结果讨论  63-65
第四章 ZNF300激活TRAF2基因表达的机制研究  65-91
  摘要  65
  4.1 前言  65-66
  4.2 实验材料和仪器  66-69
    4.2.1 血液样本  66
    4.2.2 载体  66-67
    4.2.3 试剂盒和酶  67
    4.2.4 试剂以及其配制  67-68
    4.2.5 凝胶阻滞实验所用试剂  68
    4.2.6 染色质免疫共沉所用溶液  68
    4.2.7 实验仪器  68-69
    4.2.8 细菌培养相关试剂  69
    4.2.9 数据库及分子生物学软件  69
  4.3 实验方法  69-80
    4.3.1 健康人基因组DNA的提取  69-70
    4.3.2 双酶切人基因组DNA  70
    4.3.3 PCR扩增TRAF2基因5’端调控区  70-71
    4.3.4 启动子报告实验克隆的构建和鉴定  71-74
    4.3.5 阳性克隆的测序验证  74
    4.3.6 双荧光素酶报告实验  74
    4.3.7 凝胶迁移率变化实验  74-78
    4.3.8 染色质免疫共沉淀反应(CHIP)  78-80
  4.4 实验结果  80-88
    4.4.1 人基因组DNA的提取和酶切鉴定  80-81
    4.4.2 TRAF2基因启动子的扩增和鉴定  81
    4.4.3 含TRAF2基因5’调控区的报告质粒的克隆与鉴定  81-84
    4.4.4 TRAF2基因5’调控区的截断和点突变的克隆的构建和鉴定  84-85
    4.4.5 ZNF300对TRAF2基因启动子活性的影响  85-86
    4.4.6 EMSA对ZNF300与TRAF2基因启动子结合的鉴定  86-87
    4.4.8 CHIP对ZNF300与TRAF2基因启动子结合的鉴定  87-88
  4.5 讨论  88-91
第五章探讨在体内环境下ZNF300对肿瘤生长和转移的影响  91-101
  摘要  91
  5.1 前言  91-92
  5.2 实验材料以及主要试剂  92-93
    5.2.1 实验动物  92
    5.2.2 细胞系  92
    5.2.3 试剂盒  92
    5.2.4 细胞培养所用试剂  92-93
    5.2.5 试剂和抗体  93
    5.2.6 实验仪器及设备  93
  5.3 实验方法  93-96
    5.3.1 稳转细胞的培养与ZFN300表达量的检测  93-94
    5.3.2 裸鼠肿瘤实验模型的建立  94
    5.3.4 ELISA检测IL-6和IL-8的含量  94-95
    5.3.5 HE染色与免疫组化  95-96
  5.4 实验结果  96-99
    5.4.1 稳转细胞系的构建和鉴定  96
    5.4.2 ZNF300对肿瘤生长的影响  96-97
    5.4.3 ZNF300对肿瘤细胞迁移的影响  97-99
    5.4.4 ELISA检测ZNF300对IL-6和IL-8表达量的影响  99
  5.5 结果讨论  99-101
第六章 ZNF300在U937细胞分化过程中的功能初探  101-108
  摘要  101
  6.1 前言  101-102
  6.2 实验材料以及试剂  102-103
    6.2.1 实验细胞  102
    6.2.2 细胞培养基的配制  102
    6.2.3 试剂和抗体  102-103
    6.2.4 仪器和设备  103
  6.3 实验方法  103-104
    6.3.1 U937的培养以及TPA诱导  103
    6.3.2 瑞氏-姬姆萨(MGG)染色  103-104
    6.3.3 Western blot  104
  6.4 实验结果  104-105
    6.4.1 TPA诱导U937分化的鉴定  104-105
    6.4.2 Western blot检测ZNF300在U937分化过程中表达变化  105
  6.5 讨论  105-108
研究总结  108-110
参考文献  110-124
博士研究生期间发表以及待发表的论文  124-126
致谢  126-127

ZNF300激活TRAF2介导的NF-kB信号通路促进肿瘤细胞生长

内容摘要

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