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应用糖蛋白组学技术对肿瘤特征糖蛋白的研究

作　者: 潘鹏炜
导　师: 白钢
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: 糖蛋白组学 凝集素 乳腺癌 P4HA2 点击化学 唾液酸 肺腺癌 NrCAM gp96
分类号: R73-3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本论文使用糖蛋白组学方法，对肿瘤细胞中糖蛋白进行分离纯化以及鉴定，力图寻找潜在的肿瘤标识分子，并对其在肿瘤行为中的功能进行初步的研究，为肿瘤的预后以及治疗提供可选靶点。首先，使用小扁豆凝集度（LCA）对乳腺癌细胞系Hs578T以及同源正常乳腺细胞系Hs578BST中的糖蛋白进行了富集。应用二维电泳对比结合MALDI-TOF/TOF对差异蛋白进行鉴定。实验成功鉴定在两种细胞系中显著差异表达的糖蛋白22种，其中9种参与胶原蛋白的合成及修饰过程。脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基(P4HA2)在乳腺癌细胞系中特异性表达，我们对其进行了深入的研究。首先使用realtime PCR以及免疫印迹技术，确定了P4HA2在Hs578T中的表达。应用免疫组化芯片在组织水平发现P4HA2在乳腺癌中的显著上调。最后，构建了P4HA2真核表达质粒以及应用RNA干扰发现，P4HA2的表达对Hs578T细胞的迁移和增殖能力具有抑制效果。点击化学是指可以在不干扰生物正常生化进程的同时可以在生物体内进行的一系列化学反应的应用。这些应用扩展了人们对一系列生物分子的研究能力，包括糖，蛋白以及脂类。本实验合成了叠氮乙酰甘露糖胺（Ac4ManNAz），其经细胞代谢以含有叠氮基团的唾液酸形式修饰于糖链末端。此外，实验合成了炔基标记的生物素探针，经由点击化学反应可将含有叠氮的糖蛋白生物素化。之后使用链霉亲和素标记磁珠分离生物素化蛋白。使用这一策略，我们从三种不同的腺癌细胞系，人肺腺癌A549、人宫颈腺癌HeLa和人胰腺癌SW1990中分离得到细胞表面糖蛋白。应用高分辨率液相色谱结合二级质谱(HPLC-MS/MS)分析，我们得到了三种细胞系中不同的糖蛋白表达图谱。经过生物信息学分析，共鉴定56种糖细胞表面糖蛋白被。随后，应用realtime PCR和免疫印迹的方法验证了其中部分蛋白在这三种细胞系中的表达。NrCAM是一种表达与神经系统的细胞表面粘附因子，在A549细胞中我们发现了这一蛋白的特异表达。经由免疫组化研究肺腺癌及正常肺组织，发现NrCAM不仅在非组织中有一定水平的表达，且在肺腺癌中的阳性率显著升高。但是在肺鳞癌中NrCAM的表达与正常组织却没有显著差异。同时在胰腺癌以及宫颈癌组织中并没有被检到NrCAM的表达，这与质谱鉴定的结果也相符。基于Ac4ManNAz的糖蛋白代谢标记方法，本文随后对gp96蛋白在不同癌细胞系中的唾液酸化程度进行了研究。应用上述分离方法从Hela、A549和SW1990细胞中富集细胞表面糖蛋白，于富集组分中，发现gp96蛋白含量有显著不同。而在细胞水平观察gp96的表达并无显著差异。通过酶联免疫吸附反应分析gp96的生物素化和唾液酸修饰程度发现，SW1990中的gp96的生物素化以及唾液酸化水平比Hela与A549细胞系低约30%-40%。因此推论，gp96在不同癌细胞中存在唾液酸修饰上存在差异。在胰腺腺癌细胞SW1990中，gp96的唾液酸化程度的显著降低，可能直接影响其与免疫系统的相互作用。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-16
第一章 引言  16-39
  第一节 糖蛋白  16-22
    1.1.1 蛋白编译后修饰概述  16
    1.1.2 蛋白糖基化的类型  16-19
      1.1.2.1 N-连糖蛋白  16-18
      1.1.2.2 O-连糖蛋白  18
      1.1.2.3 S-糖苷键型  18-19
      1.1.2.4 GPI 锚定蛋白  19
      1.1.2.5 C-糖蛋白  19
    1.1.3 蛋白糖的功能  19-20
    1.1.4 蛋白糖与肿瘤  20-22
  第二节 糖蛋白组学  22-29
    1.2.1 糖蛋白的富集纯化  22-26
      1.2.1.1 凝集素富集法  23-25
      1.2.1.2 硼酸法  25
      1.2.1.3 酰肼化学富集法  25
      1.2.1.4 β-消除米氏加成反应  25-26
    1.2.2 蛋白组学分析  26-29
  第三节 点击化学以及其在生物研究中的应用  29-35
    1.3.1 点击化学概念  29
    1.3.2 点击化学生物研究中的应用—生物正交反应  29-35
      1.3.2.1 叠氮化物-炔环加成（Azide-Alkyne Cycloaddition）  29-31
      1.3.2.2 无铜催化叠氮化物炔环加成（Copper-Free Azide-Alkyne Cycloaddition）  31-33
      1.3.2.3 施陶丁格链接反应（Staudinger Ligation）  33
      1.3.2.4 基于四半胱氨酸的蛋白标记（tetracysteine-based protein detection）  33-34
      1.3.2.5 羰基化合物温和的缩合反应  34-35
  第四节 细胞表面糖蛋白的分离技术  35-38
    1.4.1 细胞表面分子生物素化技术  35-37
    1.4.2 点击化学在糖蛋白组学中的应用  37-38
  第五节 目的和意义  38-39
第二章 人乳腺癌细胞糖蛋白组学研究  39-56
  第一节 材料与方法  39-47
    2.1.1 实验材料和仪器  39-43
      2.1.1.1 细胞株  39
      2.1.1.2 相关试剂  39-40
      2.1.1.3 培养基和主要试剂的配制方法  40-42
      2.1.1.4 主要仪器  42-43
    2.1.2 实验方法  43-47
      2.1.2.1 细胞培养及蛋白的提取  43
      2.1.2.2 使用 LCA 凝集素对糖蛋白的富集  43-44
      2.1.2.3 使用 TCA 沉淀对糖蛋白进行纯化  44
      2.1.2.4 双向电泳  44-45
      2.1.2.5 硝酸银染色  45-46
      2.1.2.6 二维电泳对比分析  46
      2.1.2.7 蛋白酶切及质谱鉴定  46-47
  第二节 实验结果  47-53
    2.2.1 LCA 凝集素亲和富集 Hs578BST 与 Hs578T 的 N-糖基化蛋白  47
    2.2.2 Hs578BST 与 Hs578T 的 N-糖基化蛋白组的比较分析  47-49
    2.2.3 Hs578BST 与 Hs578T 中显著差异糖蛋白的鉴定及分析  49-53
  第三节 讨论  53-55
  本章小结  55-56
第三章 P4HA2 表达及其在乳腺癌细胞系中作用的研究  56-84
  第一节 材料与方法  56-70
    3.1.1 实验材料和仪器  56-59
      3.1.1.1 细胞株  56
      3.1.1.2 相关试剂  56-57
      3.1.1.3 培养基和主要试剂的配制方法  57-59
      3.1.1.4 主要仪器  59
    3.1.2 实验方法  59-70
      3.1.2.1 Hs578T RNA 的提取  59-60
      3.1.2.2 Realtime PCR  60
      3.1.2.3 Western Blotting  60-61
      3.1.2.4 P4HA2 在乳腺癌组织中的免疫组化分析  61-62
      3.1.2.5 P4HA2 基因的扩增  62-63
      3.1.2.6 P4HA2 基因片段 PCR 产物的酶切  63
      3.1.2.7 pcDNA3.1 载体质粒的制备  63-64
      3.1.2.8 pcDNA3.1 载体质粒的酶切  64-65
      3.1.2.9 P4HA2 基因片段和 pcDNA3.1 载体质粒的连接  65
      3.1.2.10 CaCl2法转化连接产物入大肠杆菌 DH5α  65
      3.1.2.11 转化子的 PCR 初步鉴定  65-66
      3.1.2.12 转化子的酶切鉴定  66
      3.1.2.13 P4HA2 基因测序  66
      3.1.2.14 Hs578T-P4HA2 细胞的培养与瞬时转染  66-67
      3.1.2.15 Hs578T-P4HA2 细胞增殖计数  67
      3.1.2.16 Hs578T-P4HA2 细胞迁移能力检测  67-68
      3.1.2.17 P4HA2 在 Hs578T 细胞系中 RNA 干扰转染  68-69
      3.1.2.18 Hs578T-shP4HA2 细胞增殖计数  69
      3.1.2.19 Hs578T-shP4HA2 细胞迁移能力检测  69
      3.1.2.20 293T-P4HA2 细胞的培养与转染, 细胞增殖计数以及迁移能力的检测  69-70
  第二节 实验结果  70-82
    3.2.1 P4HA1，P4HA2 二维电泳结果差异  70
    3.2.2 P4HA1，P4HA2 以及 P4HB 在细胞系中表达的检测  70-71
    3.2.3 P4HA2 在乳腺癌与正常乳腺组织中的表达  71-72
    3.2.4 pcDNA3.1-P4HA2 重组质粒的构建  72-78
    3.2.5 pcDNA3.1-P4HA2 及 P4HA2-shRNA 瞬时转染及对 Hs578T 细胞行为的影响  78-79
    3.2.6 pcDNA3.1-P4HA2 瞬时转染及对 293T 细胞行为的影响  79-82
  第三节 讨论  82-83
  本章小结  83-84
第四章 基于点击化学反应标记细胞表面糖蛋白技术的建立  84-108
  第一节 材料与方法  84-93
    4.1.1 实验材料和仪器  84-85
      4.1.1.1 细胞株  84
      4.1.1.2 相关试剂  84
      4.1.1.3 培养基和主要试剂的配制方法  84-85
      4.1.1.4 主要仪器  85
    4.1.2 实验方法  85-93
      4.1.2.1 非天然单糖及探针的合成  85-86
      4.1.2.2 Ac4ManNAz 与 4-EN 的体外化学反应  86-87
      4.1.2.3 流式细胞仪检测分析  87
      4.1.2.4 激光共聚焦检测分析  87-88
      4.1.2.5 直链炔基探针的合成  88-89
      4.1.2.6 共聚焦检测合成探针活性  89
      4.1.2.7 DTT 对 Alykne-SS- Biotin 的还原反应  89-90
      4.1.2.8 共聚焦检测细胞表面糖蛋白的生物素化  90
      4.1.2.9 反应试剂对细胞膜功能的影响  90
      4.1.2.10 Alykne-SS-Biotin 细胞膜的穿透性研究  90-91
      4.1.2.11 Western blot 检测 Alkyne-LC-Biotin 标记的细胞总蛋白  91
      4.1.2.12 Western blot 检测 Alkyne-LC-Biotin 对细胞表面糖蛋白的分离  91-92
      4.1.2.13 Alkyne-SS-Biotin 对细胞表面糖蛋白的分离  92-93
  第二节 实验结果  93-106
    4.2.1 Ac4ManNAz 与 4-EN 的体外化学反应  93-94
    4.2.2 Ac4ManNAz 与 4-EN 在细胞中的化学反应  94-95
    4.2.3 直链炔基探针的合成  95-97
    4.2.4 对直链炔基探针在细胞反应性的检测  97-98
    4.2.5 Alykne-SS- Biotin 的还原断裂检测  98-99
    4.2.6 共聚焦检测细胞表面糖蛋白的生物素化  99
    4.2.7 反应试剂对细胞膜功能的影响  99-101
    4.2.8 Alykne-SS-Biotin 细胞膜的穿透性研究  101-102
    4.2.9 Alkyne-LC-Biotin 对细胞膜表面糖蛋白的分离  102-104
    4.2.10 Alkyne-SS-Biotin 对细胞膜表面糖蛋白的分离  104-106
  第三节 讨论  106-107
  本章小结  107-108
第五章 癌细胞表面糖蛋白组学研究及 NrCAM 在肺腺癌细胞中的表达  108-127
  第一节 材料与方法  108-112
    5.1.1 实验材料和仪器  108-109
      5.1.1.1 细胞株  108
      5.1.1.2 相关试剂  108
      5.1.1.3 培养基和主要试剂的配制方法  108-109
      5.1.1.4 主要仪器  109
    5.1.2 实验方法  109-112
      5.1.2.1 使用 Alkyne-SS-Biotin 分离癌细胞表面糖蛋白  109
      5.1.2.3 HPLC-MS/MS 分析 Alkyne-SS-Biotin 分离糖蛋白  109-110
      5.1.2.4 生物信息学分析  110
      5.1.2.5 对鉴定蛋白可靠性的考察  110-111
      5.1.2.6 免疫荧光检测 NrCAM 在 A549 细胞表面的表达  111
      5.1.2.7 免疫组化检测 NrCAM 在人非小细胞肺癌中的表达  111-112
  第二节 实验结果  112-124
    5.2.1 HPLC-MS/MS 鸟枪法检测  112
    5.2.2 鉴定蛋白的生物信息学分析  112-113
    5.2.3 随机鉴定蛋白表达  113-120
    5.2.4 NrCAM 在 A549 中的鉴定以及表达  120-121
    5.2.5 NrCAM 的免疫组化分析  121-124
  第三节 讨论  124-126
  本章小结  126-127
第六章 gp96 在不同癌细胞中唾液酸修饰差异的研究  127-134
  第一节 材料与方法  127-130
    6.1.1 实验材料和仪器  127
      6.1.1.1 相关试剂  127
      6.1.1.2 培养基和主要试剂的配制方法  127
      6.1.1.3 主要仪器  127
    6.1.2 实验方法  127-130
      6.1.2.1 HPLC-MS/MS 对 gp96 的鉴定  127-128
      6.1.2.2 gp96 在不同细胞中表达分析  128
      6.1.2.3 ELISA 检测 gp96 生物素化  128
      6.1.2.4 使用凝集素 WGA 检测 gp96 的唾液酸化差异  128-130
  第二节 实验结果  130-133
    6.2.1 gp96 在不同细胞系和相应细胞表面糖蛋白组分中的表达  130-131
    6.2.2 ELISA 检测 gp96 生物素化及唾液酸含量  131-133
  第三节 讨论  133
  本章小结  133-134
总结与展望  134-137
  一 总结  134-136
  二 展望  136-137
创新点  137-138
参考文献  138-144
致谢  144-145
附录  145-166
  使用 HPLC-MS/MS 在鉴定蛋白信息  145-166
个人简历  166
在学期间研究成果  166-168

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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