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阿尔茨海默病重组Aβ1-15表位嵌合疫苗研究

作　者: 刘思
导　师: 孙志伟；余云舟
学　校: 安徽大学
专　业: 微生物学
关键词: 阿尔茨海默病表位嵌合抗原免疫预防免疫治疗 β淀粉样肽 Dynamin Ⅰ
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

阿尔茨海默病是老年痴呆的一种,作为一种神经退行性疾病,它不仅使患者的学习和认知能力急剧减弱,同时也给罹患此病的病人及家庭带来的极大的痛苦和困扰。阿尔茨海默病的发病率正以惊人的速度不断增长,全球患病者人数日益增多,使得全球各个国家不得不重视该病发生发展所带来的危害和影响,因此针对该病进行有效的预防和治疗已成为当下科学研究者刻不容缓的责任。依据目前认可度较高的淀粉样假说理论,APP蛋白的异常降解导致患者大脑中积累大量可溶性Aβ42或Aβ40肽,进一步的聚集导致了大脑内淀粉样斑块的形成。同时毒性Aβ42肽的存在促进Tau蛋白的磷酸化以及神经胶质细胞的坏死等,导致一系列的病理蛋白积累及病理反应,最终促成了阿尔茨海默病的发生发展。因此靶向Ap肽的治疗方法——主动免疫和被动免疫,成为当下免疫治疗阿尔茨海默病的主流方案。通过对AN-1792临床试验失败的结果进行探究分析知,Aβ1-42肽的T细胞表位引发了自身毒性T免疫细胞反应,因此选取适当的细胞表位构建新型疫苗用以进行阿尔茨海默病的防治,且能够特异性清除最具毒性的Aβ寡聚体,是新的免疫治疗策略。正是基于这种设计理念,先前本课题组选取了Aβ1-42的B淋巴细胞表位Aβ1-15进行疫苗抗原的构建工作。采用Aβ1-15多拷贝串联连接辅助性T细胞表位载体分子的方式构建了一系列的嵌合抗原。随后完成嵌合抗原的原核表达纯化,并对所构建嵌合抗原完成了初步的免疫原性探讨,证实嵌合抗原疫苗在普通Balb/c和APP小鼠身上具有良好的免疫原性,诱导产生了具有A β42寡聚体特异结合的治疗性抗体,且能清除脑内的Aβ沉积,具有良好的疫苗效果。本研究选取了两种最具代表性且初期实验效果较优的两种表位嵌合抗原——6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C,进行深层次的免疫原性和疫苗效应评价。首先对原核表达纯化的嵌合抗原进行了免疫原性的研究。通过6Aβ15-T与不同佐剂联合免疫普通Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠,测定免疫后小鼠的抗体水平以及细胞免疫实验结果,筛选获得最优抗原佐剂配对方案。实验结果显示,嵌合抗原联合A1佐剂免疫实验小鼠后,小鼠体内能产生较强的针对Aβ42的特异性抗体,免疫反应偏向于Th2型,细胞免疫结果显示主要产生针对辅助性T细胞表位特异性的T淋巴细胞免疫反应,无Aβ42特异性的T淋巴细胞免疫反应。且以上免疫反应相较于其他佐剂联合免疫组,产生更明显的Th2型抗体反应,提示传统的人用Al佐剂作为AD疫苗的佐剂是合适并有效的。而后利用Al佐剂同时联合两种表位嵌合抗原在3xTg AD模型小鼠身上进行抗原的免疫原性研究。结果显示免疫后的AD模型小鼠体内也产生了较高水平的针对Aβ42肽的抗体,且免疫反应偏向于Th2型。淋巴细胞增殖实验结果也显示,AD模型小鼠没有产生针对Aβ42肽的自身毒性T淋巴细胞反应。AD模型小鼠免疫实验进一步证实,嵌合抗原能够克服免疫耐受,免疫后诱使机体产生较强的Th2型免疫反应,提示该疫苗具有较好的应用前景。最后,重组嵌合抗原6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C联合Al佐剂在3×Tg AD模型小鼠身上进行免疫预防和免疫治疗实验研究,以此评价疫苗效应。这两项实验分别在3M小鼠和12M小鼠身上进行。实验结果显示,3M和12M小鼠的免疫治疗过程中,两种嵌合抗原的注射均能诱使机体产生高水平的抗体,且能在体内维持较长时间。免疫反应偏向于Th2型,无Aβ42特异性T淋巴细胞反应。对水迷宫数据的统计分析结果显示,两种嵌合抗原免疫组小鼠的行为认知和记忆学习能力较未治疗小鼠有较明显的提升。同时对小鼠脑组织进行研究发现,治疗后可溶性Ap寡聚体减少,由毒性Ap诱发的一些病理指示性蛋白也发生了某些良性变化。Dynamin Ⅰ随着病程发生,表达量会降低,而治疗后小鼠与对照相比,蛋白表达量明显增高。而受毒性A β影响而发生降解的Spectrin蛋白,在治疗小鼠中能看到降解减缓的趋势。提示AD病理特征的减弱,病情好转,与典型病理指标和行为学能力表现相一致。免疫组化实验结果更为直观地显示出治疗后小鼠Ap斑块沉积明显减少,磷酸化Tau蛋白也有缓解的趋势。尽管免疫治疗的12M小鼠体内产生的抗体水平较3M小鼠产生的抗体弱,但是也能达到较高的抗体水平,能够产生有效的免疫治疗效果。以上实验结果表明,两种重组表位嵌合抗原6Aβ15-T和6Aβ15-THC-C在普通小鼠和AD模型小鼠身上均具有良好的免疫反应,能够产生A β42寡聚体特异结合的Th2型治疗性抗体。且利用这两种抗原免疫治疗AD小鼠后,AD小鼠的病理特征明显减弱,学习记忆认知能力得到较好的提升,提示这两种嵌合抗原疫苗具有良好的免疫治疗效果,可作为在免疫治疗阿尔茨海默病的候选疫苗进行临床前研发。

阿尔茨海默病重组Aβ1-15表位嵌合疫苗研究

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