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抗高迁移率族蛋白1单克隆抗体对大鼠脑出血损伤的治疗

作　者: 王登莉
导　师: 赵慧
学　校: 吉林大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 炎症 脑水肿 脑出血 高迁移率族蛋白1
分类号: R743.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


脑出血是脑中风中致死率较高的一种疾病，脑出血的治疗一直是医学界的难题，至今仍缺少有效的治疗方法。基础研究和临床研究表明：炎症机制参与脑出血后继发性脑损伤的进展过程。HMGB1是一种非组蛋白染色体结合蛋白，一旦从细胞核中释放出来，就成为促炎因子介导炎症反应。最近有报道，anti-HMGB1单克隆抗体在脑缺血和脑外伤模型中均有神经保护作用，减少脑内损伤部位细胞核内HMGB1的释放，保护血脑屏障，减少脑水肿的形成[6,7,8]。本研究建立大鼠脑出血模型后给予anti-HMGB1单克隆抗体，通过血脑屏障通透性分析、脑含水量分析、HE染色、ELISA、Western blotting及免疫组织荧光染色等方法，探讨anti-HMGB1单克隆抗体在大鼠脑出血后脑损伤修复中的作用。方法：将65只雄性Wistar大鼠（其中3只淘汰）分成三组：一组为假手术组（sham组，16只）；一组为anti-HMGB1抗体处理组（-HMGB1组，23只）；一组为对照抗体处理组（con组，23只）。采用大鼠脑纹状体内注入胶原酶IV诱导脑出血模型，0.03U（2μl）胶原酶注入纹状体后，-HMGB1组大鼠立即尾静脉注射anti-HMGB1单克隆抗体1mg/kg，6h后再次注入等量的抗体以巩固治疗；对照抗体组，给予anti-KLH对照抗体；假手术组，脑内注入生理盐水，尾静脉注入与抗体等体积生理盐水（150μl）。对于观察3天的大鼠，除上述给药流程外，ICH48h后再给药一次。取材前，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉后心脏取血，之后进行灌流固定。以损伤区为中心切取脑组织，脱水、包埋及石蜡切片。选片后，通过HE染色观察大鼠脑组织病理学形态变化，免疫组织荧光染色观察HMGB1的迁移及活化的小胶质细胞情况；Evans blue尾静脉注射，观察大鼠血脑屏障损伤情况；Western blot评估脑组织HMGB1表达水平，ELISA评估血浆中HMGB1的水平；脑含水量测定评估脑水肿情况。结果：成功建立大鼠ICH模型，且模型成功率达95.38%。Western blot结果显示大鼠ICH24h后，左侧脑组织（血肿对侧）HMGB1相对含量分别为：sham组0.94±0.05，con组0.70±0.09，-HMGB1组0.94±0.17，表明在不同组之间HMGB1变化不明显（p>0.05）；而右侧脑组织（血肿侧）sham组1.03±0.12，con组0.20±0.05，-HMGB1组0.90±0.13，con组与sham相比，HMGB1的水平明显降低；-HMGB1组与con组比HMGB1水平有明显的回升趋势（p<0.01）。ELISA检测大鼠ICH24h后血浆HMGB1水平的变化，数据分别是con组3.73±0.80ng/ml，-HMGB1组1.91±0.01ng/ml，发现-HMGB1组与con组相比，-HMGB1组有明显的减少趋势（p<0.05）。血脑屏障通透性检测结果显示，大鼠ICH6h时，每g脑组织中evans blue的漏出分别是：con组0.28±0.01ng/g，-HMGB1组0.19±0.00ng/g；ICH3d时，con组0.18±0.00ng/g，-HMGB1组0.14±0.00ng/g；-HMGB1组与con组比有明显的减少趋势（p<0.05），3d时与6h比趋势稍减少。脑含水量分析结果显示，损伤侧脑半球的含水量分别是sham组79.03±0.08%，con组81.28±0.22%，-HMGB1组80.59±0.06%，sham组与con组相比差异显著，-HMGB1组与con组相比差异明显（p<0.05）。免疫组织荧光染色结果表明，海马区域con组HMGB1的迁移更明显，血肿周围con组活化的小胶质细胞数量比-HMGB1组明显增多。结论：大鼠ICH后，应用anti-HMGB1单克隆抗体可以一定程度地抑制损伤部位HMGB1从细胞核迁移到细胞外的过程，能减少活化的小胶质细胞数，能降低血脑屏障的通透性、减轻脑水肿。

全文目录


前言  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-14
第1章 文献综述  14-24
  1.1 脑出血的病理机制  14-17
    1.1.1 原发性损伤  14
    1.1.2 继发性损伤  14-17
  1.2 脑出血模型方法  17-19
    1.2.1 自体血注入法  17-18
    1.2.2 胶原酶诱导法  18-19
  1.3 HMGB1 的研究进展  19-24
    1.3.1 基因结构和组织分布  19
    1.3.2 HMGB1 的分泌  19-20
    1.3.3 HMGB1 受体和细胞内信号传导  20-21
    1.3.4 HMGB1 激活体外系统的炎症  21-22
    1.3.5 HMGB1 与中枢神经系统的疾病  22-24
第2章 材料与方法  24-36
  2.1 实验试剂  24-26
  2.2 实验仪器  26-27
  2.3 实验试剂配制  27-28
  2.4 实验动物  28
  2.5 实验方法  28-36
    2.5.1 大鼠 ICH 模型的制备  28-29
    2.5.2 动物分组  29-30
    2.5.3 大鼠 ICH 后脑血肿的测定  30
    2.5.4 大鼠 ICH 后 Western blotting 分析脑匀浆 HMGB1 表达水平  30-31
    2.5.5 大鼠 ICH 后 ELISA 分析血浆 HMGB1 水平  31-32
    2.5.6 大鼠 ICH 后血脑屏障通透性分析  32-33
    2.5.7 大鼠 ICH 后脑含水量测定  33
    2.5.8 大鼠 ICH 后 HE 染色  33-34
    2.5.9 大鼠 ICH 后脑免疫荧光染色观察 HMGB1 和 Ibal  34-35
    2.5.10 统计分析  35-36
第3章 实验结果  36-45
  3.1 大鼠 ICH 模型的建立  36
  3.2 大鼠 ICH 后血肿体积变化  36-37
  3.3 大鼠 ICH 后脑内 HMGB1 水平的变化  37-38
  3.4 大鼠 ICH 后血浆 HMGB1 水平的变化  38-39
  3.5 大鼠 ICH 后血脑屏障通透性变化  39-40
  3.6 大鼠 ICH 后脑含水量变化  40-41
  3.7 大鼠 ICH 后 HE 染色  41-42
  3.8 大鼠 ICH 后免疫荧光染色  42-45
第4章 讨论  45-49
第5章 结论  49-50
参考文献  50-59
作者简介及在学期间所取得的科研成果  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风） > 脑出血
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