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伊拉地平干预鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞衰老及其分子机制的研究

作　者: 余小红
导　师: 李庆林
学　校:
专　业: 中药学
关键词: 鱼藤酮 伊拉地平 细胞老化 Ca2+ 线粒体氧化应激 SH-SY5Y细胞
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一种以黑质纹状体区多巴胺能神经元进行性缺失和纹状体多巴胺含量显著减少为特征的中枢神经系统变性疾病。临床主要特征是静止性震颤，肌张力增高，运动迟缓等，多发生在六十岁以上人群中，然而近年来的PD病已出现年轻化趋势。我国目前大约有200万PD患者，占全球PD患者总人数的一半，而且正以每年10万新增病例的速度递增，成为继心脑血管疾病和老年痴呆症后，严重威胁我国中老年人身心健康的“第三杀手”。本课题通过采用鱼藤酮作用于SH-SY5Y细胞建立体外帕金森病模型，研究伊拉地平通过抑制鱼藤酮诱导细胞内Ca2+增加和线粒体氧化应激，干预鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞老化，延缓帕金森病发病的进程。目的：研究伊拉地平对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞老化的保护作用，并探讨其保护机制。方法：采用MTT法检测伊拉地平/EGTA预处理后，鱼藤酮作用不同时间点，细胞生长和增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞后的凋亡率；Western blotting法检测鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞后Caspase-3蛋白变化；Fluo-3/AM染色荧光显微镜下观察伊拉地平/EGTA预处理后用鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞后细胞内Ca2+荧光强度；酶标仪检测细胞内Ca2+荧光强度；采用SA-β-gal试剂盒检测不同处理的SH-SY5Y细胞内β-gal的活性；采用Elisa脂褐素试剂盒检测细胞内脂褐素的含量，透射电子显微镜观察细胞内脂褐素的形成；流式细胞仪PI单染检测细胞周期的改变；流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）的产生；Western blotting法检测p53，p16，p21，CDK2，cyclinD1，AKT，p-AKT等相关蛋白的表达变化。结果：（1）MTT实验结果表明鱼藤酮在一定时间和浓度下对SH-SY5Y细胞的增殖有明显抑制作用，且呈一定的时效和量效关系；伊拉地平/EGTA预处理后，鱼藤酮对细胞的增殖抑制作用明显降低，伊拉地平/EGTA作用48h效果明显。（2）Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果表明，鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞可以导致细胞凋亡发生，但细胞凋亡率并不随作用时间的延长而增加；Westernblotting法检测cleaveg-caspase3蛋白的表达也不随作用时间的延长而增加。（3）Fluo-3/AM染色结果发现，鱼藤酮作用后细胞内Ca2+的荧光强度增加，且呈一定的时效量效关系；伊拉地平/EGTA预处理后，细胞内Ca2+的荧光强度降低。（4）SA-β-gal试剂盒检测发现，鱼藤酮作用后细胞内的β-gal活性增加；伊拉地平/EGTA预处理后，细胞内的β-gal活性降低。（5）Elisa检测结果发现，鱼藤酮作用后细胞内的脂褐素含量增加，且呈一定的时效量效关系；伊拉地平/EGTA预处理后，细胞内脂褐素的含量下降。（6）透射电镜观察结果发现造模后细胞核呈现不规则的固缩，线粒体内膜断裂并有少数呈现空泡样变性，细胞膜以及细胞器膜模糊，同时溶酶体中出现大量的脂褐素颗粒物质。（7）流式细胞仪检测结果发现，鱼藤酮作用后细胞内的活性氧含量增加；伊拉地平/EGTA预处理后，细胞内活性氧的含量降低。（8）PI单染流式细胞仪检测结果显示，鱼藤酮作用后细胞大部分被阻滞在G1/G0期；伊拉地平/EGTA预处理后，G1/G0期的细胞减少，S/G2/M期的细胞增多。（9）Western blotting检测结果发现，鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞不同时间后p53、p16、p21的蛋白表达量逐渐增加，CDK2、cyclinD1、p-AKT蛋白的表达量则逐渐降低；伊拉地平/EGTA预处理后， p53、p16、p21的蛋白表达量降低，CDK2、cyclinD1、p-AKT蛋白的表达量增加。结论：鱼藤酮可能是通过诱导细胞内Ca2+增加和线粒体氧化应激，导致细胞老化，其作用机制可能与鱼藤酮激活p53、p16、p21等相关蛋白的表达及下调AKT的磷酸化，抑制细胞周期蛋白CDK2、cyclinD1等蛋白的表达，阻滞细胞G1/G0期有关；伊拉地平可以抑制细胞内Ca2+增加，保护线粒体损伤，抑制p53、p16、p21等相关蛋白的表达，激活p-AKT和细胞周期蛋白CDK2、cyclinD1等蛋白的表达，延缓细胞老化的进程，进而发挥神经保护作用，延缓PD的进程。

全文目录


中文摘要  9-11
ABSTRACT  11-16
前言  16-19
第一部分 鱼藤酮通过诱导细胞内 Ca~(2+)水平变化及氧化应激引起 SHSY5Y 细胞的老化  19-37
  1 实验材料及仪器  19-21
    1.1 细胞株  19
    1.2 药物  19
    1.3 主要试剂  19
    1.4 主要试剂配制  19-20
    1.5 主要仪器  20-21
  2 实验方法  21-25
    2.1 细胞培养和传代  21
    2.2 细胞冻存和复苏  21
      2.2.1 细胞冻存  21
      2.2.2 细胞复苏  21
    2.3 细胞分组  21-22
    2.4 鱼藤酮药液的配制  22
    2.5 细胞计数方法  22
    2.6 药物敏感性试验（MTT 法）  22
    2.7 倒置显微镜观察鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞形态的影响  22-23
    2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡率（AnnexinV/PI 双染）  23
    2.9 Western blotting（WB）法检测细胞中 cleavageCaspase3 蛋白表达水平  23
    2.10 细胞老化实验  23-24
      2.10.1 细胞化学法检测β半乳糖苷酶活性  23
      2.10.2 Elisa 试剂盒检测细胞内脂褐素的含量  23-24
      2.10.3 透射电镜观察细胞内脂褐素的形成  24
    2.11 鱼藤酮对细胞内 Ca~(2+)浓度的影响  24-25
    2.12 流式细胞术检测细胞内活性氧含量  25
    2.13 统计学方法  25
  3. 结果  25-35
    3.1 鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞活力的影响（MTT 法）  25-26
    3.2 倒置显微镜观察鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞形态的影响  26
    3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率（AnnexinV/PI 双染）  26-27
    3.4 Western blotting 法检测细胞中 cleavageCaspase3 蛋白表达水平  27-28
    3.5 鱼藤酮诱导 SHSY5Y 细胞衰老  28-31
      3.5.1 细胞化学法检测 SAβ半乳糖苷酶活性  28-29
      3.5.2 Elisa 试剂盒检测细胞内脂褐素的含量  29
      3.5.3 透射电镜观察细胞内脂褐素的形成  29-31
    3.6 鱼藤酮对细胞内 Ca~(2+)浓度的影响  31-33
    3.7 流式细胞仪检测细胞内活性氧含量  33-35
  4 讨论  35-36
    4.1 鱼藤酮诱导细胞内 Ca~(2+)浓度的增加  35-36
    4.2 鱼藤酮诱导线粒体氧化应激  36
  5 小结  36-37
第二部分 伊拉地平和 EGTA 干预鱼藤酮诱导 SHSY5Y 细胞老化的研究  37-48
  1 实验材料及仪器  37-39
    1.1 细胞株  37
    1.2 药物  37
    1.3 主要试剂  37
    1.4 主要试剂配制  37-38
    1.5 主要仪器  38-39
  2 实验方法  39-41
    2.1 细胞培养、传代、复苏和冻存  39
    2.2 实验分组及药物处理  39
    2.3 伊拉地平对鱼藤酮损伤 SHSY5Y 细胞的敏感性试验（MTT 法）  39
    2.4 倒置显微镜观察伊拉地平对鱼藤酮损伤 SHSY5Y 细胞形态的影响  39-40
    2.5 细胞老化实验  40
      2.5.1 细胞化学法检测β半乳糖苷酶活性  40
      2.5.2 Elisa 试剂盒检测细胞内脂褐素的含量  40
    2.6 细胞内 Ca~(2+)浓度的检测  40-41
    2.7 流式细胞术实验  41
      2.7.1 流式细胞仪检测细胞周期（PI 单染）  41
      2.7.2 流式细胞术检测细胞内活性氧含量  41
    2.8 统计处理方法  41
  3 结果  41-46
    3.1 伊拉地平对鱼藤酮损伤 SHSY5Y 细胞的影响（MTT 法）  41-42
    3.2 倒置显微镜观察伊拉地平和 EGTA 对鱼藤酮损伤 SHSY5Y 细胞形态的影响  42-43
    3.3 伊拉地平对鱼藤酮引起的 SHSY5Y 细胞老化的影响  43-44
      3.3.1 细胞化学法检测β半乳糖苷酶活  43
      3.3.2 Elisa 试剂盒检测细胞内脂褐素的含量  43-44
    3.4 细胞内 Ca~(2+)浓度的检测  44-45
    3.5 流式细胞术实验  45-46
      3.5.1 流式细胞仪检测细胞周期（PI 单染）  45
      3.5.2 流式细胞术检测细胞内活性氧含量  45-46
  4. 讨论  46-47
    4.1 细胞衰老和氧化应激  46-47
    4.2 细胞衰老和细胞周期停滞  47
  5. 小结  47-48
第三部分 伊拉地平对鱼藤酮所致 SHSY5Y 细胞老化的分子机制研究  48-61
  1 实验材料及仪器  48-51
    1.1 细胞株  48
    1.2 药物  48
    1.3 主要试剂  48-49
    1.4 主要试剂配制  49-50
    1.5 主要仪器  50-51
  2 实验方法  51-54
    2.1 实验分组  51
    2.2 细胞处理  51
    2.3 蛋白样品制备  51-52
    2.4 蛋白含量的测定  52
    2.5 SDS－PAGE 凝胶电泳  52-54
    2.6 统计处理方法  54
  3 实验结果  54-57
    3.1 鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞 p53、p21、p16 蛋白表达的影响  54-55
    3.4 鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞 CDK2 和 cyclinD1 蛋白表达的影响  55
    3.5 鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞 AKT 及 pAKT 蛋白表达的影响  55-56
    3.6 伊拉地平干预后鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞 p53、p21 和 p16 蛋白表达的影响  56
    3.9 伊拉地平干预后鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞 CDK2 和 cyclinD1 蛋白表达的影响  56-57
    3.10 伊拉地平干预后鱼藤酮对 SHSY5Y 细胞 AKT 及 pAKT 蛋白表达的影响  57
  4 讨论  57-60
    4.1 细胞衰老和帕金森病  57-58
    4.2 p53/p21、p16 与细胞衰老  58-59
    4.3 细胞衰老和 AKT 的磷酸化  59-60
  5 小结  60-61
总结  61-63
实验线路图  63-64
参考文献  64-70
综述  70-81
  参考文献  76-81
个人简历  81
硕士期间发表的科研论文  81-82
致谢  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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