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己酮可可碱对氯化锂—匹罗卡品所致癫痫发作大鼠黑质—尾壳核多巴胺能神经元的改善作用

作　者: 薛岩
导　师: 石葛明
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经生物学
关键词: 己酮可可碱 癫痫发作 多巴胺 鼻腔给药 黑质 尾壳核
分类号: R742.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


癫痫(Epilepsy, EP)是一反复发作、大脑神经元异常猝发放电导致的短暂或持续性脑功能失常为特征的慢性疾病。研究发现，癫痫发作(epileptic seizure, ES)与脑内多巴胺能神经体系(dopaminergic system)密切相关。癫痫发作大鼠脑内多巴胺(dopamine, DA)受体密度发生了明显改变，癫痫患者脑脊液内DA及其代谢产物高香草酸（HVA）含量显著下降，抗癫痫治疗后含量有所升高，暗示DA能神经体系在癫痫发作过程中受到了损害。目前癫痫发生的机制尚不明确，有研究证实癫痫持续状态下脑内神经元的过度放电与氧自由基的生成有关，Freitas等人的研究证实了活性氧自由基对癫痫发作大鼠神经元的损伤作用。因此，通过抑制过度活动的神经化学通路可减少氧自由基的产生，减轻神经元的损伤，进而改善癫痫发作相关的症状，这可能是癫痫治疗的途径之一。己酮可可碱（Pentoxifylline, PTX）是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，具有强抗氧化作用，可清除体内的氧自由基。PTX最初用于外周血管和呼吸系统疾病的治疗。近期研究发现，PTX可用于治疗缺血性脑损伤和中风等神经系统疾病；此外Geanne等发现PTX可以改善谷氨酸所致海马损伤大鼠的学习和记忆能力；幼鼠预先腹腔注射PTX，可降低氯化锂-匹罗卡品(lithium-pilocarpine, Li-Pc)诱发癫痫的发作率，减轻癫痫发作程度，具有一定的抗癫痫和神经保护作用。癫痫发作过程中黑质-尾壳核(SN-CPu) DA能神经元受到损伤，PTX是否对癫痫发作过程中SN-CPuDA能神经元的损伤有改善作用目前尚未有研究显示。癫痫发作起病突然，且常为院外发作，发作持续时间越长，脑内神经元损伤越严重，甚至会危及患者的生命，及时有效地终止癫痫发作可以减轻脑内神经元损伤，提高患者的生活质量。目前有研究通过鼻腔给药方式治疗癫痫发作，鼻腔给药既方便又快捷，是某些药物制剂首选的给药方法，但目前尚不确定预先鼻腔给予PTX对癫痫发作是否有效。Li-Pc所致大鼠癫痫模型表现出海马门区神经元的死亡及苔藓纤维的出芽,具有与人类颞叶癫痫相似的病理和临床特征，是理想的颞叶癫痫模型,适用于探讨癫痫形成机理及筛选抗癫痫药物。因此，本课题以Li-Pc所致癫痫发作大鼠为动物模型，利用实时定量反转录PCR、免疫印迹和液质联用技术，检测反映DA能神经元功能活动强弱的相关指标，探讨预先腹腔和鼻腔给予PTX对大鼠SN-CPu处DA能神经元功能活动的影响，期望所获结果为癫痫发作的防治提供一定的实验依据。目的：观察PTX对于癫痫发作大鼠SN-CPu处DA能神经元的影响，探讨腹腔和鼻腔两种PTX给药方式对癫痫发作大鼠SN-CPu处DA能神经元的影响效果，期望所获结果为癫痫发作及其治疗提供一定的实验依据。方法：将雄性Wistar大鼠(300g左右)随机分为腹腔给药组和鼻腔给药组。（1）腹腔给药组：50只大鼠被随机分为5组，即空白对照组（Con.ip）、氯化锂组（Li.ip）、PTX腹腔给药对照组（PTX.ip）、癫痫组（ES.ip）、PTX腹腔给药组（ES+PTX.ip）。Con.ip组和PTX.ip腹腔注射生理盐水（127mg/kg）, Li.ip组腹腔注射氯化锂（127mg/kg）；ES.ip和ES+PTX.ip用Li-Pc诱导癫痫发作，先腹腔注射氯化锂（127mg/kg），20h后腹腔注射匹罗卡品（15mg/kg）；PTX.ip和ES+PTX.ip在匹罗卡品注射前30min分钟通过腹腔给予PTX（60mg/kg）。每组10只(5只用于液质联用和实时定量反转录PCR，5只用于免疫印迹)。（2）鼻腔给药组：50只大鼠被随机分为5组，即空白对照组（Con.in）、氯化锂组（Li.in）、PTX鼻腔给药对照组（PTX.in）、癫痫组（ES.in）、PTX鼻腔给药组（ES+PTX.in）。鼻腔给药组：Con.in组和PTX.in腹腔注射生理盐水（127mg/kg），Li.in组腹腔注射（127mg/kg）；ES.in和ES+PTX.in用Li-Pc诱导癫痫发作，先腹腔注射氯化锂（127mg/kg），20h后腹腔注射匹罗卡品（15mg/kg）；PTX.in和ES+PTX.in在匹罗卡品注射前30min分钟通过鼻腔给予PTX（60mg/kg）。每组10只(5只用于液质联用和实时定量反转录PCR，5只用于免疫印迹)。实验动物造模成功后第八天，通过实时定量反转录PCR和免疫印迹检测经腹腔和鼻腔预先给予PTX两种给药方式对癫痫大鼠SN-CPu处酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)mRNA和多巴胺转运体(dopaminetransporter, DAT) mRNA及TH和DAT表达的影响，并通过液质联用检测经腹腔和鼻腔预先给予PTX两种给药方式对癫痫大鼠SN-CPu处DA及其代谢产物的作用。结果：1经腹腔给予PTX对SN-CPu处DA能神经元的影响1.1实时定量反转录PCR结果通过实时定量反转录PCR，我们检测了大鼠SN处TH mRNA和DATmRNA表达的变化。与Con.ip组相比，PTX.ip组大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA的相对表达分别升高了19%（P<0.01）和16%（P<0.01）；与Con.ip组相比，ES.ip大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA相对表达分别降低了28%（P<0.01）和26%（P<0.01）；与ES.ip组相比，ES+PTX.ip的TH mRNA和DAT mRNA的相对表达分别升高了30%（P<0.01）和34%（P<0.01），接近正常水平。1.2免疫印迹结果经腹腔给予PTX对TH表达的影响：与Con.ip组相比，PTX.ip组大鼠TH在SN、CPu的相对表达分别升高了31%（P<0.05）、21%（P<0.05）；与Con.ip组相比，ES.ip组SN、CPu处TH的相对表达分别降低了48%（P<0.01）、45%（P<0.01）；与ES.ip组相比，ES+PTX.ip组的SN、CPu处TH的相对表达分别升高了91%（P<0.01）、89%（P<0.05），接近Con.ip组水平。经腹腔给予PTX对DAT表达的影响：与Con.ip组相比，PTX.ip组大鼠SN、CPu处糖基化DAT（Glycosylated-DAT，Glyco-DAT）的相对表达分别升高了26%（P<0.05）、9%（P<0.05）；与Con.ip组相比，ES.ip组在SN、CPu处Glyco-DAT的相对表达分别降低了54%（P<0.01）、46%（P<0.01）；与ES.ip组相比，ES+PTX.ip组的SN、CPu处Glyco-DAT的相对表达分别升高了114%（P<0.01）、73%（P<0.01），接近于Con.ip组水平。各组间非糖基化DAT（Non-Glycosylated-DAT, Non-Glyco-DAT）的相对表达没有显著改变。1.3液质联用结果液质联用结果分析发现：与Con.ip组相比，PTX.ip组大鼠CPu处DA、二羟苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)和HVA水平分别升高了11%（P<0.05）、14%（P<0.05）和17%（P<0.05）；与Con.ip组相比，ES.ip组大鼠CPu处DA、DOPAC和HVA水平分别降低了41%（P<0.01）、45%（P<0.01）和47%（P<0.01）；与ES.ip组相比，ES+PTX.ip组大鼠的DA、DOPAC和HVA水平分别升高了65%（P<0.01）、56%（P<0.01）和53%（P<0.01），DA含量接近正常水平，DOPAC和HVA水平仍明显低于Con.ip组。ES+PTX.ip组大鼠的(DOPAC+HVA)/DA、DOPAC/DA和HVA/DA相对值均比Con.ip大鼠分别降低了9%（P<0.05）、8%（P<0.05）和12%（P<0.05）。其余各组间无明显差异。2经鼻腔给予PTX对SN-CPu处DA能神经元的影响2.1实时定量反转录PCR结果与Con.in组相比，PTX.in组大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA的相对表达分别升高了18%（P<0.05）和21%（P<0.01）；与Con.in组相比，ES.in大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA的相对表达分别降低了28%（P<0.01）和32%（P<0.01）；与ES.in组相比，ES+PTX.in的TH mRNA和DAT mRNA的相对表达分别升高了35%（P<0.01）和48%（P<0.01），接近正常水平。2.2免疫印迹结果经鼻腔给予PTX对TH表达的影响：与Con.in组相比，PTX.in组大鼠TH在SN、CPu的相对表达分别升高了21%（P<0.05）、18%（P<0.05）；与Con.in组相比，ES.in组SN、CPu处TH的相对表达分别降低了59%（P<0.01）、51%（P<0.01）；与ES.in组相比，ES+PTX.in组的CPu、SN处TH的相对表达升高，接近于正常水平。经鼻腔给予PTX对DAT表达的影响：与Con.in组相比，PTX.in组大鼠CPu、SN的Glyco-DAT的相对表达分别升高了43%（P<0.01）、17%（P<0.01）；与Con.in组相比，ES.in组在CPu、SN处的Glyco-DAT的相对表达分别降低了57%（P<0.01）、53%（P<0.01）；与ES.in组相比，ES+PTX.in组的CPu、SN处Glyco-DAT的相对表达分别升高了138%（P<0.01）、117%（P<0.01），接近于Con.in组。各组间Non-Glyco-DAT在CPu和SN的相对表达无明显差异。2.3液质联用结果与Con.in组相比，PTX.in组大鼠CPu的DA、DOPAC和HVA水平分别升高了12%（P<0.05）、15%（P<0.05）和13%（P<0.01）；与Con.in组相比，ES.in组大鼠CPu的DA、DOPAC和HVA水平分别降低了43%（P<0.01）、36%（P<0.01）和45%（P<0.01）。经鼻腔给予癫痫大鼠PTX后，ES+PTX.in组大鼠的DA水平和DOPAC和HVA水平接近Con.in组，比ES.in组大鼠分别升高了68%（P<0.01）、40%（P<0.01）和69%（P<0.01）。五组间(DOPAC+HVA)/DA、DOPAC/DA和HVA/DA相对值无明显差异。3经腹腔和鼻腔两种给药途径，各个观察指标在空白对照组与Li组之间均无明显改变。4腹腔和鼻腔给予PTX对SN-CPu处DA能神经元影响的比较通过实时定量反转录PCR和免疫印迹观察了SN和CPu处THmRNA、DAT mRNA、TH和DAT的表达改变；通过液质联用分析了CPu处DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量及相对比值。鼻腔给予PTX使各观察指标恢复到正常水平；腹腔给药组仅增加了DOPAC和HVA的含量，未恢复到正常水平，其余各指标恢复至正常水平。结论：1PTX增强大鼠SN-CPu处DA能神经元的功能活动。2Li-Pc所致癫痫发作的大鼠SN-CPu处DA能神经元的功能活动减弱。3鼻腔给予PTX对Li-Pc所致癫痫发作大鼠SN-CPu处DA能神经元功能活动的改善作用优于腹腔给药方式。

全文目录


摘要  4-9
ABSTRACT  9-16
英文缩写  16-17
前言  17-18
材料与方法  18-29
结果  29-33
附图  33-51
附表  51-55
讨论  55-56
结论  56-57
参考文献  57-63
综述 癫痫与脑内多巴胺体系关系的研究进展  63-73
  参考文献  68-73
致谢  73-74
个人简历  74

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 癫痫
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