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利用TALEN技术向人诱导多能干细胞引入癫痫相关SCN1A基因突变

作　者: 陈皖娟
导　师: 李志远
学　校: 安徽大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 转录激活效应器核酸酶(TALENs) 人诱导多能干细胞(iPSC) 癫痫钠离子通道的α亚基
分类号: R742.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)也被称作Dravet氏综合征,是一种难以治疗的癫痫病。婴幼儿严重肌阵挛性癫痫有许多复杂的病症,如：严重的难治性癫痫症状,伴随发病的共济失调和认知障碍。并且婴幼儿严重肌阵挛性癫痫对典型的抗癫痫痉挛的药物治疗都有抵抗作用。多年的研究证明,这种癫痫的遗传病因是钠通道的突变。而且由SCNIA基因编码的电压门控型钠离子通道的α亚基是最常见的突变发生位点。已经在婴幼儿严重肌阵挛性癫痫病人发现了不同类型的SCN1A基因突变包括：无义突变,移码突变,错义突变,这些突变发生在SCN1A基因的不同位置。一些研究团队提出这样的假设：癫痫病症的严重程度是由突变发生在SCN1A基因上的位置决定的。然而,至今癫痫的疾病表型与基因型之间的联系仍然不确定。一些关于癫痫的发病机理的研究表明：引起婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的基因突变会导致突变钠离子通道功能的丧失,表现为内向钠电流显著地减小甚至电流的完全消失。基于以上实验提出假设：这种减小的钠电流会造成神经系统的超兴奋和导致癫痫相关的痉挛。并且在动物模型上的研究结果也与这个假设相符并一致表明那些引起钠通道功能丧失的突变都会严重损伤氨基丁酸(GABA)能抑制性中间神经元的钠电流,从而导致了婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的超兴奋。关于婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的分子致病机理仍需要进一步的研究。TALEN是基因工程中一个重要的高效的工具,它可以在活细胞的基因组的特异的基因序列上切出缺口。TALEN主要是由两部分组成的。一部分是转录激活效应器(TAL),它是一种黄单胞菌属的植物病原细菌的毒力因子。这种转录激活效应器(TAL)的原始功能就是在通过细菌Ⅲ型分泌系统侵染进入宿主细胞后破坏宿主细胞原有的基因调控系统并且与效应器特异性识别的基因组序列结合。TALEN的另一部分是FokI核酸酶,它可以有效地切割识别的DNA序列,由于可以在体内特异性地创造出双链的DNA断裂缺口(DSBs),从而被用于基因操作。由于FokI核酸酶只有在二聚体的状态下才能切割DNA,所以这些TAL效应器的核酸酶(TALENs)在切割DNA缺口时也是成对发生作用的。然而这些在细胞里的双链缺口(DSBs)可以通过细胞自身的非同源性末端接合(NHEJ)进行修复,但非同源性末端接合(NHEJ)会损伤打靶基因导入小片段的插入和缺失。这些双链缺口(DSBs)也可以通过同源重组(HR)进行修复,但这需要一个同源的DNA片段作为模版去复制跨过缺口的信息,这种修复可以被用作基因的插入和替换。到目前为止,科学家在研究神经退行性疾病上遇到了许多困难。人诱导多能干细胞(hiPSC)技术可以将人体细胞人工地重编程到一种多能性的状态,然后可以将这些多能性的细胞分化成几乎任何类型的与疾病相关的细胞、组织,所以它为体外神经疾病的建模提供了几乎无限的疾病相关的、病人特异性的成体细胞。同时人诱导多能干细胞(hiPSC)技术可以避开与胚胎干细胞(ES)相关的伦理道德问题以及潜在的同种异体的免疫排斥问题。总之,与疾病相关的基因修复的病人特异性诱导多能干细胞的获得是生物医学研究和药物开发领域的一个重大进展。通常,我们会拿病人来源的疾病相关的细胞系和一株正常人的细胞系作比较,然而这种比较存在很大的缺陷。一方面,神经退行性疾病在体内通常都有一个较长的潜伏期和一个缓慢的细胞病变过程,而且大部分都是晚年才发病的。更重要的是,在体外这些疾病的表型都很微弱。另一方面,这两株细胞系不同的基因背景也为体外研究增加了一个很大的阻碍,因为任何我们观察到的这两株细胞系的区别都不能被定义成到底是疾病相关的损伤还是因为不同的遗传背景。所以,要从不可预知的遗传背景变化中区别这些微弱的但是与疾病相关的表型变化是很困难的,这需要更严格的使遗传背景相匹配的研究方法。因此,为了建立一个遗传背景确定的实验系统去研究癫痫的治病机理,我们做的工作主要包括：1、获得了一株正常人来源的诱导多能干细胞株(iPSCs),这株诱导多能干细胞株是由皮肤成纤维细胞重编程获得的并且拥有正常的基因型。然后我们设计了打靶SCN1A基因的TALEN,并且对这株干细胞的内源性基因组(SCN1A)进行了基因修饰。结合iPSC和TALEN技术,我们突变了正常人来源的诱导多能干细胞的SCN1A基因,引入了点突变A5768G,于是我们成功构建了一株“人造病人”细胞株。2、同时,我们获得了病人来源的皮肤成纤维细胞,利用重编程技术将这株细胞重编程为iPS细胞,并利用TALEN技术,对引起疾病的基因突变进行修复,构建了一株“突变修复”细胞株。3、基因修复后,我们检测了各细胞株的多能性。证明这些iPS细胞株都保持了多能性。4、并且将这些iPS细胞系成功分化成有功能的神经元。基于以上所有的工作,我们将研究正常人来源的细胞系和构建的“人造病人”细胞系以及病人来源的细胞株和疾病修复的细胞株,这种情况下,我们感兴趣的与疾病相关的基因病变将是唯一的变量。这种技术可以成功地对iPS细胞进行疾病相关的基因操作,并为研究癫痫的治病机理和药物筛选建立了细胞模型。因此我们希望可以做出更准确更可信的关于致病机理的阐述,甚至是对癫痫的治疗给出合理的建议。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-10
目录  10-13
缩略词表  13-15
引言  15-41
  1. 癫痫  15-28
    1.1 癫痫  15-16
    1.2 婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)  16-28
      1.2.1 婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)及其临床诊断  16-17
      1.2.2 婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的治疗  17-18
      1.2.3 引起婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的基因病变  18-22
      1.2.4 婴幼儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的致病机制  22-28
        1.2.4.1 突变造成钠离子通道电流减小  22-26
        1.2.4.2 突变造成钠离子通道表达量的变化  26-28
  2. 人诱导多能干细胞(hiPS)  28-37
    2.1 人诱导多能干细胞(hiPS)的起源与诞生  28-29
    2.2 人诱导多能干细胞(hiPS)的技术革新  29-31
    2.3 人诱导多能干细胞(hiPS)的疾病模型  31-33
    2.4 利用人诱导多能干细胞建立疾病细胞模型的注意问题  33-34
    2.5 人诱导多能干细胞(hiPS)与神经退行性疾病  34-35
    2.6 细胞替代治疗  35-37
  3. 基因工程  37-41
    3.1 锌指核酸酶(ZFNs)  38
    3.2 类转录激活因子核酸酶(TALEN)  38-41
材料与方法  41-67
  1. 材料  41-46
    1.1 细胞株  41
    1.2 菌株,质粒和动物  41
    1.3 常用试剂盒  41-42
    1.4 常用抗体、工具酶和化学试剂  42-44
    1.5 主要实验仪器和器材  44
    1.6 实验所用引物  44-46
  2. 实验方法  46-67
    2.1 病人来源iPS细胞的获得  46-49
      2.1.1 iPS细胞诱导  46-48
      2.1.2 iPS细胞鉴定  48-49
    2.2 病人来源的iPS/正常人来源的iPS的基因打靶  49-57
      2.2.1 iPS细胞的培养,传代,冻存  49
      2.2.2 Donor,TALEN质粒的构建  49-53
        2.2.2.1 Donor质粒构建  49-53
        2.2.2.2 TALEN质粒构建  53
      2.2.3 TALEN切割效率  53-55
      2.2.4 利用TALEN技术引入突变  55
      2.2.5 突变鉴定  55-56
      2.2.6 药筛基因(Neo)的切除  56-57
      2.2.7 基因打靶后多能性鉴定  57
        2.2.7.1 免疫荧光  57
        2.2.7.2 畸胎瘤  57
    2.3 疾病修复的细胞株(AN)/人造病人的细胞株(AP)神经元获得  57-60
      2.3.1 神经元分化  57-58
      2.3.2 神经元鉴定  58-60
        2.3.2.1 免疫荧光  58-59
        2.3.2.2 电生理鉴定  59
        2.3.2.3 RT-PCR  59-60
    2.4 TALEN脱靶研究  60-61
    2.5 Southern Blot  61-67
      2.5.1 探针制作  61-63
      2.5.2 基因组DNA制备  63
      2.5.3 基因组DNA的限制性酶切  63
      2.5.4 基因组DNA消化产物的乙醇沉淀浓缩  63-64
      2.5.5 基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳  64
      2.5.6 DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物  64-65
      2.5.7 杂交  65-66
      2.5.8 洗膜与检测  66-67
结果  67-82
  1、实验概述  67-68
  2、病人来源的细胞重编程为iPS细胞及鉴定  68-71
  3、Donor和TANLEN质粒构造  71-72
  4、利用TALEN的基因操作  72-75
  5、基因操作后NoriPS细胞(AP)的多能性鉴定  75-77
  6、iPS细胞向神经元分化  77-79
  7、iPS细胞分化来源的神经元电生理研究  79-82
讨论  82-85
参考文献  85-93
致谢  93-95
附录  95-99
硕士期间发表论文  99

利用TALEN技术向人诱导多能干细胞引入癫痫相关SCN1A基因突变

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