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硫化氢对人绒毛膜前列腺素代谢酶的调节及其机制

作　者: 孙倩倩
导　师: 古航
学　校: 第二军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 绒毛膜硫化氢 15-羟基前列腺素脱氢酶 microRNA
分类号: R722.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

早产在我国的发病率约为8.1%,其近远期并发症较多,给家庭和社会带来巨大的精神和经济压力,但由于人类分娩发动的确切机制尚未完全阐明,临床上仍缺乏预测和治疗早产的有效措施。分娩是一个多因素参与的复杂的生理变化过程,妊娠期间大部分时间子宫均处于静息状态,而至妊娠末期,子宫开始出现规律宫缩,并逐渐加强,最终促使胎儿娩出体外。且在该过程中,羊膜、绒毛膜、胎盘等宫内组织来源的前列腺素(prostaglandin, PG)发挥重要作用。目前的研究显示：绒毛膜可高表达前列腺素代谢酶-NAD依赖的15-羟基前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprosglandin dehydrogenase, PGDH),由于其处于羊膜和子宫肌之间,妊娠期绒毛膜高表达的PGDH构成一道前列腺素代谢屏障,调控胎膜PG到达子宫肌的量。本实验室前期研究提示分娩启动和H2S有相关性,但进一步的研究尚未进行。因此本课题首先以原代培养的人绒毛膜滋养层细胞为研究对象,首先确定原代培养的细胞中有CBS和CSE的表达,且有产生内源性H2S的能力。然后明确H2S对PGDH表达和生物活性的调节作用,利用RNA干扰技术,进一步明确在人绒毛膜细胞中内源性H2S生成的关键酶。很多的研究发现：microRNA几乎参与了生物的所有病理生理过程,如发育、增殖、凋亡、癌变等,且2009年已经有研究报道,多种microRNA在分娩前后、早产临产前后有差异表达,这就提示我们microRNA参与了分娩启动这一生理过程,且在心血管系统,已经有研究显示,H2S可上调miR-133a的表达。为此,本课题进一步探讨了H2S调控PGDH的microRNA机制。接下来,本课题首先构建了含有PGDH3’UTR双荧光报告基金的质粒及针对microRNA结合位点进行点突变的突变体质粒,利用双荧光报告基因检测系统明确不同rnicroRNA对PGDH3’UTR是否有直接靶作用,并利用Western blot方法探讨H2S是否可通过对以上rnicroRNA的影响实现对PGDH的调节,并最终参与到对局部前列腺素浓度的调节中。最后我们在组织水平检测不同妊娠状态下,CBS、PGDH和不同microRNAs的表达变化情况,从细胞和组织两水平说明microRNA可参与妊娠维持和分娩启动过程中。主要实验结果如下：1、H2S对原代培养人绒毛膜滋养层细胞中PGDH表达和生物活性的影响为说明原代培养的绒毛膜细胞有产生内源性H2S的能力,我们原代培养绒毛膜滋养层细胞,利用PCR和Western blot方法显示细胞中有H2S合成酶CBS、CSE的表达,利用极谱法证明细胞有产生内源性H2S的能力；real time PCR方法显示细胞内CBS的量显著多于CSE;real-time PCR和Western blot及ELISA方法的结果显示,原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中H2S可时间和剂量依赖性的促进PGDH表达和生物活性,采用CBS的阻断剂AOAA以及siRNA特异性敲低内源性CBS表达后,L-半胱氨酸上述的促进作用被阻断。以上结果证明：内源性H2S主要在CBS的作用下产生,并发挥对PGDH表达和生物活性的上调作用。2、H2S调节原代培养绒毛膜滋养层细胞中PGDH表达和活性的可能机制在原代培养的绒毛膜滋养细胞中,为明确miR-26a/b和miR-199a是否为PGDH的靶基因,首先,利用瞬时转染的方法将miR-26a、miR-26b和miR-199a的类似物(inhibitors)和抑制物(mimics)转入细胞,结果发现：抑制miR-26b、miR-199a的表达后,PGDH的蛋白表达增加,促进它们的表达后,PGDH的蛋白表达减少；而miR-26a的inhibitor和mimic对PGDH的蛋白表达没有影响,提示PGDH可能是miR-26b和miR-199a的靶基因,而PGDH可能不是miR-26a的靶基因；接下来,构建含有miR-26a/b、miR-199a结合位点的PGDH3’UTR荧光素酶报告基因质粒及其针对上述microRNA结合位点进行点突变的突变体质粒,将其和上述microRNA的类似物共转染细胞,结果发现,miR-26b和miR-199a均可降低PGDH3’UTR的荧光素酶活性,而针对它们的结合位点进行点突变后,上述抑制作用消失,这就证明了PGDH是miR-26b和miR-199a的靶基因。而miR-26a对PGDH3’UTR的荧光素酶活性没有影响,证明了PGDH不是miR-26a的靶基因。为进一步说明H2S是否可通过miR-26b和miR-199a实现对PGDH的上调作用,本课题首先验证了H2S可抑制miR-26b和miR-199a的表达;然后给予miR-26b和miR-199a的类似物预处理细胞后,再给予NaHS和L-半胱氨酸处理细胞,结果发现,H2S对PGDH的上调作用消失了,综合以上结果得出：PGDH是miR-26b、miR-199a的靶基因；H2S能通过抑制miR-26b、 miR-199a的表达,实现对PGDH的上调作用,虽然miR-26a不是PGDH的靶基因,但其表达仍受到H2S的调节。3、足月临产、足月未临产、自发性早产绒毛膜组织中CBS、PGDH和miR-26a、miR-26b、miR-199a的表达为在组织水平验证足月临产和早产临产前后CBS、PGDH和上述microRNA是否发生改变,本课题组收集足月临产、足月未临产、自发性早产绒毛膜组织各10例,利用RT-PCR方法检测,结果显示,与足月未临产组相比,足月临产组的绒毛膜组织中,CBS和PGDH的表达显著减少,miR-26b和miR-199a的表达均显著增加,与足月临产组相比,CBS和PGDH的表达进一步减少,miR-26b和miR-199a的表达均增加更显著；而miR-26a表现出与此相反的趋势。结果与细胞结果一致。结论：CBS在内源性H2S的生成过程中发挥主要的作用；PGDH是miR-26b和miR-199a的靶基因；H2S通过减少miR-26b和miR-199a的表达,实现对PGDH的上调作用,从而减少到达宫体的前列腺素浓度,进而参与到妊娠维持和分娩启动的过程中。

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