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线粒体融合蛋白2对小鼠植入前早期胚胎发育的影响及机制研究

作　者: 赵娜
导　师: 相文佩
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: Mfn2 小鼠睾丸支持细胞 细胞转染 siRNA 线粒体融合蛋白2 基因沉默 早期胚胎发育 囊胚形成率 线粒体 ATP 线粒体膜电势 细胞凋亡 植入前胚胎发育
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的确定小鼠线粒体融合素基因2（Mitofusin2，Mfn2）小干扰RNA（Small interferingRNA，siRNA）转染所需最佳浓度，筛选沉默Mfn2效率最高的siRNA序列。方法分别将20nM、30nM、50nM和100nM的Cy3标记siRNA转染至TM4细胞，24h后观察细胞荧光强度，筛选出Cy3-siRNA最佳转染浓度；以Lipofectamine2000为转染介质，将预先设计的三条Mfn2-siRNA序列分别转染TM4细胞，通过荧光定量PCR（quantity Real Time-PCR）检测转染细胞的Mfn2mRNA的相对表达量。结果不同浓度Cy3-siRNA转染的细胞中，20nM、30nM、50nM和100nM的转染效率分别为20%、30%、70%和90%，其中50nM和100nM转染荧光强度明显增强，转染效率高；在预选的3条Mfn2-siRNA序列中，同control-siRNA转染组相比，Mfn2-siRNA1、Mfn2-siRNA2和Mfn2-siRNA3组Mfn2表达量百分比分别为6.20%、3.08%和17.68%。Mfn2-siRNA转染组均较control-siRNA组明显下降（P<0.05），其中Mfn2-siRNA2转染细胞的Mfn2mRNA表达量最低。结论当Cy3-siRNA浓度为50nM时，TM4细胞转染效率已达所需水平，故确定50nM为siRNA最佳转染浓度；在预选的3条Mfn2-siRNA序列中，Mfn2-siRNA2（5’CUGGACAGCUGGAUUGAUAdTdT3’，3’dTdTGACCUGUCGACCUAACUAU5’）转染细胞的Mfn2表达量最低，为最佳转染序列。目的观察Mfn2-siRNA对小鼠受精卵体外分裂速度及囊胚形成率的影响。方法使用Mfn2的最佳转染序列（Mfn2-siRNA2）及对照序列（control-siRNA）合成化学修饰的siRNA，分别转染至小鼠输卵管分离的两细胞受精卵中，通过荧光定量PCR检测干扰效率并观察两组中受精卵的分裂速度及囊胚形成率。结果Mfn2-siRNA中Mfn2的表达量为control-siRNA转染组受精卵的0.8%，Mfn2-siRNA转染组明显低于control-siRNA组（P<0.05）， Mfn2-siRNA较control-siRNA转染组受精卵生长速率明显减慢，Mfn2-siRNA和control-siRNA囊胚形成率分别为23.19%和72.95%，Mfn2-siRNA转染组显著降低。结论Mfn2-siRNA转染组的受精卵与control-siRNA转染组相比生长速率明显下降，囊胚形成率降低，表明Mfn2可影响小鼠植入前胚胎的发育，Mfn2的正常表达对小鼠受精卵的发育具有重要作用。目的观察Mfn2基因沉默对小鼠胚胎早期发育过程中线粒体功能的影响，探讨Mfn2对小鼠植入前胚胎发育影响的作用机制。方法分别收集Mfn2-siRNA和control-siRNA转染组的囊胚30个，用萤火虫荧光素酶法检测囊胚的ATP含量，用JC-1染料测量囊胚中的线粒体膜电位。用FITC标记的重组人AnnexinⅤ荧光探针检测小鼠早期胚胎凋亡情况。结果Mfn2-siRNA转染组的囊胚ATP含量显著降低（P<0.05）及细胞线粒体膜电位低于control-siRNA转染组；Mfn2-siRNA转染组的细胞凋亡明显较control-siRNA转染组多。结论与control-siRNA转染组相比，Mfn2-siRNA转染组小鼠囊胚ATP产生减少，线粒体膜电位降低，表明Mfn2表达降低抑制线粒体能量代谢；Mfn2-siRNA转染组细胞凋亡率增加，表明Mfn2的低表达可导致线粒体途径诱导的细胞凋亡增加。结果提示Mfn2可能通过影响小鼠植入前胚胎中的线粒体能量代谢和线粒体途径诱导的凋亡参与胚胎早期发育。

全文目录


中英文缩略词一览表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-14
引言  14-18
  参考文献  16-18
第一部分 Mfn2 基因干扰序列的筛选及最佳转染浓度的确定  18-33
  材料和方法  18-27
  结果  27-30
  讨论  30-31
  参考文献  31-33
第二部分 Mfn2 基因沉默对小鼠植入前胚胎发育的影响  33-43
  材料和方法  34-36
  结果  36-39
  讨论  39-40
  参考文献  40-43
第三部分 Mfn2 影响小鼠植入前胚胎发育的机制探讨  43-53
  材料和方法  44-47
  结果  47-49
  讨论  49-51
  参考文献  51-53
实验小结  53-55
综述  55-67
  参考文献  61-67
硕士期间发表或待发表的论文  67-68
致谢  68

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