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子宫内膜轻创对小鼠胚泡植入的影响和机制研究

作　者: 张晓慧
导　师: 廖爱华
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子宫内膜轻创胚胎植入动物模型子宫内膜容受性胞饮突白血病抑制因子致癌蛋白M
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 3次
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内容摘要

2003年，Barash等首次报道在人类IVF周期的前一月经周期的第8、12、21和26天分别进行内膜搔刮，可明显提高胚胎植入率、临床妊娠率和活胎分娩率。此后，国内外相继有多篇临床报道均获得相同的结论。然而，受人子宫内膜取材的限制，这一临床现象背后隐藏的原因和机制还不是十分清楚，相关报道比较匮乏。本研究通过建立子宫内膜轻创的小鼠模型，为进一步探讨子宫内膜轻创提高着床率和妊娠率的机制研究提供实验模型。我们推测子宫内膜轻创后妊娠结局的改善可能与子宫内膜局部形态学的改变和细胞因子代偿性分泌增加，继而改善了子宫内膜容受性有关。妊娠需要子宫内膜腺体的支持，胞饮突被认为是子宫内膜容受性形成的重要形态学标志，它的出现与胚胎的种植率密切相关。白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）和致癌蛋白M（Oncostatin M，OSM）均属于白细胞介素6家族的成员；LIF是胚胎着床的关键因子，在着床窗口期特异性表达，被认为是重要的子宫内膜容受性分子。OSM与LIF有很多相似性，特别在血管生成和创伤愈合中有独特作用。本研究以课题组建立的子宫内膜轻创小鼠模型为实验对象，从形态学方面（子宫内膜腺体和胞饮突改变）和子宫内膜局部细胞因子产生（LIF、OSM mRNA和蛋白表达）两个方面，来探讨子宫内膜轻创提高小鼠胚泡着床的机制，这将为子宫内膜轻创在临床的推广应用提供科学的实验依据。目的：建立子宫内膜轻创小鼠模型，探讨子宫内膜轻创对小鼠胚泡植入的影响，为后续机制研究提供实验模型。方法：将昆明小鼠（雌鼠）随机分为四组：空白对照组（不开腹、不致创）(n=14)、手术对照组（仅开腹）（n=13）、单侧轻创组（一侧子宫内膜致创）（n=14）和双侧轻创组（两侧子宫内膜致创）（n=13）。经阴道涂片确定昆明小鼠动情期，麻醉后打开腹腔，用1ml的注射器（去尖）进入子宫腔轻轻搔刮子宫内膜，轻创后关腹；在下一动情期雌雄合笼（按2:1比例），查出阴栓确定为妊娠第1天，在妊娠第8天处死小鼠，检查子宫，记录每只孕鼠左侧、右侧子宫着床胚胎数及总的胚胎数，比较各组间的差异。结果：单侧轻创组与手术对照组比较，轻创侧（右侧）胚胎数多于手术对照组右侧的胚胎数，分别为7.501.83和5.541.05，差异有统计学意义（P <0.05）；双侧轻创组与手术对照组比较，其左侧、右侧及胚胎总数明显高于手术对照组，分别为7.381.81vs.5.621.98，7.692.69vs.5.541.05和15.082.43vs.11.152.19，其差异均有统计学意义（P <0.05）。结论：轻创小鼠子宫内膜能明显提高小鼠胚胎着床数，此模型将为后续机制研究提供实验模型。目的：从形态学方面，探讨子宫内膜轻创对小鼠子宫内膜容受性的影响。方法：取昆明小鼠妊娠第四天的子宫组织，采用伊红-苏木素法（Hematoxylin-eosinstaining，HE）检测正常对照组、手术对照组和子宫内膜轻创组三组子宫腺体的表达情况；用扫描电镜（Scanning electron microscopy，SEM）检测三组子宫内膜表面胞饮突的发育及表达情况。结果：HE染色的结果显示，正常对照组子宫内膜腔上皮排列整齐，腺体丰富，间质区域少；手术对照组子宫内膜肌层变薄，腺体较少，腺体分泌物少，间质的面积增多；双侧轻创组子宫肌层厚度增加，腔上皮排列整齐，腺体大而弯曲，数目多，腺体的分泌物旺盛，间质的面积减少。SEM检测结果显示，正常对照组内膜表面胞饮突均匀分布，有些表面不光滑，胞饮突数量没有双侧轻创组丰富；手术对照组子宫内膜表面的胞饮突数量较双侧轻创组明显减少；双侧轻创组子宫内膜均匀分布着大量胞饮突，大小均匀，边界清楚，表面光滑，仅少数可见短而小的微绒毛，为大量完全发育的胞饮突。结论：与正常对照组相比，双侧轻创组子宫内膜厚度增加，腺体数量增多，分泌物丰富，胞饮突数量丰富，发育完全。手术对照组则腺体发育不良，胞饮突的表达数量较双侧轻创组明显减少。子宫内膜轻创通过刺激子宫内膜，增加了内膜腺体增生和胞饮突的表达，进而提高了子宫内膜的容受性。目的：从子宫内膜局部两种分子：白血病抑制因子（LIF）和致癌蛋白M （OSM）表达方面，探讨子宫内膜轻创对小鼠子宫内膜容受性的影响。方法：取昆明小鼠妊娠第四天的子宫内膜组织，采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应（Quantitative reverse transcript polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白印迹（Western blot，WB）方法，分别检测LIF mRNA、OSM mRNA及其蛋白在正常对照组、手术对照组和双侧轻创组子宫内膜的表达。结果：与手术对照组相比，双侧轻创组的LIF mRNA和OSM mRNA的表达量明显增加，差异有统计学意义（P <0.05）。LIF和OSM蛋白在正常对照组、双侧轻创组和手术对照组的子宫内膜均有表达。与正常对照组相比，LIF在双侧轻创组的表达明显增加（P <0.01），而在手术对照组的表达明显降低（P <0.05）；OSM蛋白在三组的表达趋势与LIF蛋白相似，双侧轻创组OSM蛋白表达也明显高于手术对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。结论：LIF和OSM的mRNA及蛋白在双侧轻创组的表达明显高于手术对照组，这提示子宫内膜轻创可能通过刺激子宫内膜局部代偿性地产生LIF和OSM因子，从而增加了子宫内膜容受性，促进胚胎植入。1.建立了子宫内膜轻创的动物模型：子宫内膜轻创可改善妊娠结局的现象在临床上得到多次证实，由于来自人子宫内膜组织取材有限，又缺乏针对性的实验动物模型，因此，难以对其机制进行深入研究。本研究以小鼠作为研究对象，建立了可靠的子宫内膜轻创动物模型，实验操作简单，周期短，可重复性好，且动物子宫内膜取材方便，来源丰富，有利于从整体水平和细胞分子水平开展研究。2.提出了新理论：目前有关子宫内膜轻创提高临床着床率、妊娠率和活胎分娩率的机制尚不是十分清楚。本研究以课题组建立的小鼠子宫内膜轻创模型为实验对象，率先提出了可能的机制：即与子宫内膜轻创提高了子宫内膜容受性有关，具体表现在改善了局部腺体增生、胞饮突形成和发育，以及刺激了子宫内膜代偿性分泌细胞因子LIF和OSM。3.引入了新的研究指标：OSM作为IL-6家族成员之一，其抑制肿瘤生长、促进血管再生、参与组织修复等生物学功能在心血管和肿瘤领域已为人们所认可，但其在生殖方面的作用尚未得到充分认识。本研究基于OSM与LIF的结构和功能的相似处，以及其在创伤后血管再生和修复方面的独特作用，将其引入到生殖研究领域，发掘了其在提高子宫内膜容受性方面的新作用。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-12
Abstract  12-16
引言  16-21
  参考文献  19-21
第一部分子宫内膜轻创小鼠模型的建立  21-32
  材料方法  21-24
  结果  24-29
  讨论  29-30
  参考文献  30-32
第二部分子宫内膜轻创提高小鼠胚泡植入的机制研究  32-60
  实验一子宫内膜轻创对小鼠容受期子宫内膜形态学的影响  32-40
    材料方法  32-35
    结果  35-36
    讨论  36-38
    参考文献  38-40
  实验二子宫内膜轻创对白血病抑制因子和致癌蛋白 M 表达的影响  40-60
    材料方法  41-51
    结果  51-56
    讨论  56-58
    参考文献  58-60
实验小结  60-61
综述  61-69
  参考文献  66-69
硕士期间发表的论文  69-70
致谢  70

子宫内膜轻创对小鼠胚泡植入的影响和机制研究

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