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妊娠期孕鼠接触SEB对子代成年大鼠T细胞的印迹效应及机制的研究

作　者: 余峰玲
导　师: 管俊昌
学　校:
专　业: 病原生物学
关键词: SEB 妊娠 T细胞亚群子代流式细胞术
分类号: R714.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：金黄色葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B，SEB）既是一种毒素性物质，又是一种超抗原。SEB作为一种肠毒素少量进入人体内即可导致严重的疾病，作为一种超抗原可以刺激机体免疫系统中大量T细胞活化增殖。SEB进入机体后，初期可激活Vβ8+T细胞并诱发大量增殖，继而过度增殖的细胞发生凋亡导致克隆清除，而出现中枢或外周耐受。本实验室前期研究发现妊娠期孕鼠接触SEB导致子代新生鼠T细胞亚群比例的改变，表明妊娠期孕鼠接触SEB已在新生儿期对子代鼠细胞免疫产生影响，那么这种改变是否可保留至成年期形成印迹效应，目前国内外尚未见报道。因此，我们在前期研究基础上，研究妊娠期孕鼠接触SEB对子代成年大鼠胸腺、脾脏和血液中CD4/CD8T细胞及Vβ8.2T细胞亚群的影响；研究妊娠期孕鼠接触SEB对子代成年大鼠体外培养的脾淋巴细胞增殖应答的影响；研究子代成年大鼠细胞免疫对再次接受SEB刺激的免疫应答反应；研究子代成年大鼠外周血中IFN-γ及IL-4的水平及脾脏淋巴细胞中IFN-γ及IL-4基因的甲基化水平。其研究结果将为妊娠期接触SEB对子代细胞免疫的影响提供实验依据，也为探讨一些胎源性疾病提供理论依据。方法：1．选用清洁级成年SD大鼠，交配及确定受孕后，孕鼠饲养至妊娠16天随机分组，实验组（SEB组）孕鼠通过尾静脉注射15μg SEB，同时设立对照组，给予等体积的PBS（磷酸盐缓冲液），继续饲养孕鼠至自然分娩，让子代新生鼠生长至成年时期，即获得子代成年大鼠。2．取子代成年大鼠胸腺、脾脏及外周血，制备单细胞悬液，荧光抗体（CD3FITC、CD8PE、CD4APC）染色后流式细胞仪检测CD4/CD8T细胞。3．取子代成年大鼠的胸腺及外周血，制备单细胞悬液，荧光抗体（Vβ8.2FITC、CD8PE、CD3APC）染色后流式细胞仪检测Vβ8.2T细胞。4．再次给予子代成年大鼠静脉注射SEB，同时设立同窝子代大鼠注射SEB作为对照组，5天后获取其胸腺、脾脏及外周血，分离其淋巴细胞，荧光抗体（CD3FITC、CD8PE、CD4APC）染色后流式细胞仪检测CD4/CD8T细胞。5．再次给予子代成年大鼠静脉注射SEB，同时设立同窝的子代大鼠作为对照组，5天后取其胸腺及外周血，分离其淋巴细胞，染色后经流式细胞仪检测Vβ8.2T细胞。6．无菌条件下取出子代成年大鼠的脾脏，分离淋巴细胞并进行体外培养，分别给予ConA及SEB连续刺激3天，每天取出培养的细胞检测其增殖指数及其T细胞亚群。7．获取子代成年大鼠的血浆，ELISA检测IFN-γ及IL-4的水平。8．获取子代成年大鼠的脾脏，通过MeDIP-qPCR检测IL-4及IFN-γ基因的甲基化水平。结果：1．孕鼠接触SEB对子代成年大鼠细胞免疫的影响（1）妊娠期接触SEB对子代成年大鼠胸腺、脾脏及外周血中T细胞亚群的影响：SEB组子代成年雌雄性大鼠胸腺、脾脏及外周血中CD4+CD8T细胞的比例较PBS组明显增加，而CD4CD8+T细胞的比例较PBS组明显减少；（2）妊娠期接触SEB对子代成年大鼠胸腺及外周血Vβ8.2T细胞的影响：妊娠期接触SEB可明显减少子代成年雌雄性大鼠胸腺及外周血中Vβ8.2T细胞的比例。2．再次注射SEB对妊娠期已接触SEB孕鼠的子代成年大鼠CD4/CD8T细胞的影响妊娠期已接触SEB的子代成年雌雄性大鼠，与同窝对照组比较，再次接触SEB时可明显减少胸腺中CD4+CD8T细胞的比例，而增加CD4CD8+T细胞的比例；在子代成年雌雄性大鼠脾脏及外周血中T细胞亚群表现出与胸腺中相类似的变化。3．再次注射SEB对妊娠期已接触SEB的子代成年大鼠Vβ8.2T细胞的影响妊娠期已接触SEB的子代成年雌雄性大鼠，再次注射SEB时对胸腺中Vβ8.2T细胞的比例与对照组比较无差异，但外周血中Vβ8.2T细胞的比例却较同窝对照组明显增加。4．SEB刺激对体外培养的子代成年大鼠脾细胞的影响实验发现随着刺激时间增加体外培养的子代成年大鼠脾细胞的增殖能力逐渐增强，而且SEB组的子代成年雌雄性大鼠脾细胞接受SEB的刺激能力较ConA组弱；检测T细胞亚群发现，给予SEB刺激时SEB组培养的脾细胞中CD4+CD8T细胞的比例较ConA组减弱，但对CD4CD8+T细胞的比例无明显影响。5．妊娠期孕鼠接触SEB对子代成年大鼠外周血中细胞因子的影响ELISA检测结果发现SEB组子代成年大鼠外周血中IFN-γ及IL-4的水平分别较PBS组明显增加；在成年期再次给予SEB刺激后，其（PBS+SEB，SEB+SEB）IFN-γ及IL-4水平均较各自对照组（PBS+PBS，SEB+PBS）明显减少。6．妊娠期孕鼠接触SEB对子代成年大鼠DNA甲基化的影响实验发现SEB组子代成年大鼠脾脏中IFN-γ及IL-4基因的甲基化水平均较PBS组明显减少。结论：1．妊娠期接触SEB改变了子代成年大鼠中枢及外周中CD4/CD8T细胞及Vβ8.2T细胞的比例；2．妊娠期接触SEB改变子代成年大鼠CD4/CD8T细胞及Vβ8.2T细胞对再次SEB刺激的免疫应答反应；3.妊娠期接触SEB减弱子代成年大鼠脾淋巴细胞体外的增殖能力，增殖能力减低可能与CD4+T细胞亚群减少有关；4.妊娠期接触SEB增加子代成年大鼠外周血中的细胞因子IL-4及IFN-γ水平，可能与其DNA甲基化减少有关。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-15
材料与方法  15-24
结果  24-38
讨论  38-42
结论  42-43
参考文献  43-47
致谢  47-48
附录  48-57
  附录A 英中文术语缩略语对照表  48-49
  附录B 常用试剂配制  49-50
  附录C 个人简历  50-51
  附录E 综述  51-57
    参考文献  56-57

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