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人子宫内膜的体外构建及Ang-(1-7)和AngⅡ对子宫内膜细胞和子宫内膜组织的影响

作 者: 单铁英
导 师: 张雷
学 校: 河北医科大学
专 业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 子宫内膜基质细胞 子宫内膜上皮细胞 组织工程 Ⅰ型液态鼠尾胶原 Matrigel AngⅡ Ang-(1-7) α-SMA ColⅠ TGF-β1 IGF-I E-cadherin FN 子宫内膜纤维化
分类号: R711.4
类 型: 博士论文
年 份: 2014年
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内容摘要


目的:宫腔粘连或纤维化是指因不规范宫腔操作、人工流产术、继发感染等原因所造成的子宫腔部分或全部粘连而引起的一组症候群。其发生率为20-30%。临床上常出现月经减少、闭经和不育。这一不良结局主要体现在不孕不育的人群逐渐增加。即使采取手术治疗,粘连再形成率高达50%。随着辅助生殖技术的发展,许多相关问题得到解决,但在辅助助孕妊娠失败病例中有相当一部分由宫腔粘连或纤维化导致。目前对于子宫粘连或纤维化的机制还不清楚,国内外尚缺少有效的诊断与防治手段。因此,急需相关基础与临床研究,阐明子宫内膜粘连或纤维化的机制,从而研发新的诊治技术,预防并进行有效治疗。本研究探讨以人子宫内膜上皮细胞和基质细胞作为种子细胞,以Ⅰ型液态鼠尾胶原和Matrigel胶为生物支架能否在体外按自然状态的子宫内膜结构构建出具有三维立体结构的组织工程化子宫内膜,并且对其进行形态学与免疫组织化学分析;从而将为子宫内膜的研究提供有益的实验模型,并为最终构建具有完整结构的组织工程化子宫提供实验依据。在细胞、基因和蛋白水平,探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(l-7)]和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人子宫内膜上皮细胞和基质细胞数目和活性的影响,并且探讨Ang-(l-7)和AngⅡ对在体外构建的人子宫内膜组织的影响,为子宫内膜粘连或纤维化的防治提供新的思路和理论依据。方法:1人子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的分离、纯化、培养及鉴定采用酶消化和离心法在体外分离、纯化和培养原代人子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用4%台盼蓝染色进行活细胞计数和观察细胞活力;采用光学显微镜、倒置显微镜和H&E染色观察子宫内膜上皮细胞和基质细胞的形态和结构;用免疫细胞化学方法鉴定子宫内膜上皮细胞和基质细胞;用MTT法观察雌二醇(E2)和孕酮(P4)对上皮细胞和基质细胞增殖的影响。2体外子宫内膜三维立体结构的构建,培养及鉴定制备Ⅰ型液态鼠尾胶原,以Ⅰ型液态鼠尾胶原和Matrigel为生物支架,将分离出的子宫内膜基质细胞培养传代后作为种子细胞,接种在胶原中形成基质细胞-胶原复合物,等其凝固后,再把Matrigel覆盖在复合物上,把上皮细胞接种在Matrigel上,在体外按自然子宫内膜的结构构建出具有三维立体结构的组织工程化子宫内膜,并且对其进行形态学与免疫组织化学分析。3血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人EECs增殖的影响体外培养正常人EECs,采用MTT法观察不同浓度(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L) AngⅡ作用EECs24h、48h和72h后对其增殖的影响。4血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对AngⅡ诱导的EECs增殖的影响观察不同浓度(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L) Ang-(1-7)和AngⅡ(10-6mol/L)对EECs作用24h、48h和72h后增殖的影响。5Ang-(1-7)和AngⅡ对的子宫内膜上皮细胞活性的影响体外培养正常人EECs,将细胞分为对照组、AngⅡ(10-6mol/L)组,Ang-(1-7)(10-5mol/L)组和AngⅡ+Ang-(1-7)组。继续培养细胞72h后,用免疫细胞化学染色法检测EECs中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮性钙粘附素(E-cadherin)的表达水平;用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清液中细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)和纤粘连蛋白(FN)的含量;用western blot检测EECs中α-SMA和E-cadherin的表达水平;Real time PCR检测α-SMAmRNA、E-cadherin mRNA、FN mRNA和Col I mRNA的表达水平。6AngⅡ对ESCs增殖的影响体外培养正常人ESCs,采用MTT法观察不同浓度(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L) AngⅡ作用子宫内膜基质细胞24h、48h和72h后对其增殖的影响。7Ang-(1-7)对AngⅡ诱导的ESCs增殖的影响观察不同浓度(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L) Ang-(1-7)和AngⅡ(10-6mol/L)作用ESCs24h、48h和72h后对其增殖的影响。8Ang-(1-7)和AngⅡ对的ESCs活性的影响体外培养正常人ESCs,将细胞分为对照组、AngⅡ(10-6mol/L)组,Ang-(1-7)(10-5mol/L)组和AngⅡ+Ang-(1-7)组。继续培养细胞72h后,用免疫细胞化学染色法和western blot检测ESCs活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)的表达水平;用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清液中TGF-β1、IGF-I、ColⅠ和FN的含量;Rime Time PCR检测ESCs中ColⅠmRNA、FNmRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1mRNA和IGF-I mRNA的表达水平。9Ang-(1-7)和AngⅡ对的子宫内膜组织活性的影响在体外构建子宫内膜的三维立体结构模型,将构建的子宫内膜分为四组:对照组、Ang-(1-7)组、AngⅡ组和Ang-(1-7)+AngⅡ组,用western blot检测子宫内膜的α-SMA、TGF-β1和IGF-I蛋白表达水平;Real Time PCR检测子宫内的α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA和IGF-I mRNA的表达水平。结果:1子宫内膜上皮细胞及基质细胞的分离、培养与鉴定用离心法获得的的子宫内膜上皮细胞在倒置显微镜下观察呈团状或葡萄串状,其细胞纯度>90%。4%的台盼蓝溶液检测细胞存活率达92%~96%,24h后已贴壁生长,3天后细胞长成旋涡状排列的致密单层细胞集落,单个细胞形态呈类圆形或椭圆形,细胞核大而圆,一个,多位于细胞的中央,核仁明显。用DMEM/F12和10%的胎牛血清培养子宫内膜上皮细胞不能传代。H&E染色并在光学显微镜下观察:上皮细胞形态呈类圆型或蝌蚪型,细胞核大而圆,一个,多位于细胞的中央,核仁明显,染色质疏松浅染;细胞质相对较多,胞质呈颗粒状,嗜酸性。免疫细胞化学检测结果显示:可见上皮细胞胞质Cytokeratin染色阳性,呈棕黄色,细胞核为阴性,不显色,而vimentin染色阴性。用离心法获得的子宫内膜基质细胞在倒置显微镜下观察呈单个分散的细胞,其细胞纯度>92%。4%的台盼蓝溶液检测细胞存活率达95%~98%,将分离的基质细胞接种在培养瓶中培养,2h已开始贴壁,12h已开始生长,细胞体向两端突起,似出芽。细胞生长约3~4天即聚合成片。用DMEM/F12和10%的胎牛血清培养子宫内膜基质细胞可以传3~4代,培养早期的细胞光镜下可见两种形态,多数为梭形,另一种为多边形或星形,细胞核大呈椭圆形,一个,多位于细胞的中央,核仁明显。H&E染色并在光学显微镜下观察:基质细胞形态呈梭形、多边形或星形,细胞核大呈椭圆形,一个,多位于细胞的中央,核仁明显,染色质疏松浅染;细胞质相对较多,胞质呈嗜酸性,染为粉红色。免疫细胞化学检测:可见基质细胞胞质vimentin染色阳性,呈棕黄色,细胞核为阴性,不显色,而Cytokeratin染色阴性。MTT法观察雌二醇(E2)和孕酮(P4)对上皮细胞和基质细胞增殖的影响:E2和P4单独作用并不能显著增加子宫内膜上皮细胞增殖(P>0.05),但100nmol/L的E2和10nmol/L的P4对子宫内膜上皮细胞的增殖作用显著(P<0.05),实验的研究发现,当上皮细胞与少量基质细胞混合培养在100nmol/L的E2和10nmol/L的P4的环境下时,上皮细胞能够很好地传至5~6代,而100nmol/L的P4对子宫内膜基质细胞的增殖作用显著(P<0.05)。2体外构建子宫内膜三维立体结构的培养及鉴定构建具有两层结构的组织工程化子宫内膜在DMEM/F12培养液中培养第三天时,片层开始收缩,并随时间的延长,收缩逐渐明显。四根玻璃柱对片层起到静态拉伸作用,同时还能防止过度收缩导致片层变厚。组织工程化子宫内膜经H&E染色后显示:对培养14天的组织工程化子宫内膜取材,组织学研究发现,经过14天的培养,子宫内膜上皮细胞和基质细胞状态良好,上皮层细胞在液态胶原材料表面积聚生长,细胞近圆形,体积比基质细胞略大,细胞与细胞之间紧密相连,有些部位上皮呈扁平状,但也有很多部位的上皮呈现正常子宫内膜所特有的极化柱状形态,这为其发挥相应的功能打下了结构基础。组织工程化子宫内膜免疫组化鉴定结果显示:上皮层呈上皮角蛋白抗体(Cytokeratin)阳性,而基质层中的基质细胞呈Cytokeratin阴性。基质层中的基质细胞呈波形蛋白抗体(vimentin)阳性,而上皮层呈vimentin阴性。3AngⅡ对子宫内膜上皮细胞增殖的影响子宫内膜上皮细胞培养24h,48h和72h后,紫色结晶通过测定550nm每个培养孔的吸光度值(A)观察子宫内膜上皮细胞数目变化情况:AngⅡ可诱导子宫内膜上皮细胞数目明显增加(P <0.05),且AngⅡ有呈剂量和时间依赖性地促进子宫内膜上皮细胞增殖作用;但24h与对照组比较,无统计学意义(P>0.05),48h,72h时,AngⅡ组细胞数目与对照组比较明显增加(P<0.05)。4Ang-(1-7)对AngⅡ诱导的子宫内膜上皮细胞增殖的影响子宫内膜上皮细胞培养24h,48h和72h后,紫色结晶通过测定550nm每个培养孔的吸光度值(A)观察子宫内膜上皮细胞数目变化情况:Ang-(1-7)组与对照组比较无明显差异(P>0.05);与对照组相比,AngⅡ组可诱导子宫内膜上皮细胞数目明显增加(P <0.05);而与AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang-(1-7)组的子宫内膜上皮细胞数目明显减少(P<0.05)。5Ang-(1-7)和AngⅡ对的子宫内膜上皮细胞活性的影响细胞培养72h后,免疫细胞化学染色法检测结果表明:对照组细胞有少量α-SMA阳性表达,大量的E-cadherin的阳性表达; Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组细胞α-SMA表达明显增加而E-cadherin的表达明显降低;与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞α-SMA表达明显降低而E-cadherin的表达明显增加(P<0.05)。细胞培养72h后,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测结果表明:与对照组比较,Ang-(1-7)组细胞上清液中FN和Col I含量无明显改变,AngⅡ组细胞上清液中FN和Col I的含量明显升高(P<0.05);与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞上清液中FN和Col I含量明显减少(P<0.05)。细胞培养72h后,western blot检测结果显示:对照组细胞有少量α-SMA阳性表达,大量的E-cadherin阳性表达;Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组细胞α-SMA表达明显增加(P<0.05),E-cadherin的表达明显减少(P<0.05);与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞α-SMA表达明显减少(P<0.05),E-cadherin的表达明显增加(P<0.05)。与免疫细胞化学染色法结果一致。细胞培养72h后,Real time PCR检测结果显示:对照组细胞有少量α-SMA mRNA、FN mRNA和Col I mRNA阳性表达,大量的E-cadherinmRNA阳性表达; Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组细胞α-SMA mRNA、FN mRNA和Col I mRNA表达明显增加(P<0.05),E-cadherin mRNA的表达明显减少(P<0.05);与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞α-SMA mRNA、FN mRNA和Col I mRNA表达明显减少(P<0.05),E-cadherin mRNA的表达明显增加(P<0.05)。与免疫细胞化学染色法和western blot的检测结果一致。6AngⅡ对子宫内膜基质细胞增殖的影响子宫内膜基质细胞培养24h,48h和72h后,紫色结晶通过测定550nm处每个培养孔的吸光度值(A)观察子宫内膜基质细胞数目变化情况:AngⅡ可诱导子宫内膜基质细胞数目明显增加(P <0.05),且AngⅡ有呈剂量依赖性地促进子宫内膜基质细胞增殖作用;AngⅡ组细胞随着培养时间延长,子宫内膜基质细胞增殖作用越明显,但24h与对照组比较,无统计学意义(P>0.05),48h,72h时,AngⅡ组细胞数目与对照组比较明显增加(P<0.05)。7Ang-(1-7)对AngⅡ诱导的子宫内膜基质细胞增殖的影响子宫内膜基质细胞培养24h,48h和72h后,紫色结晶通过测定550nm每个培养孔的吸光度值(A)观察子宫内膜基质细胞数目变化情况:Ang-(1-7)组与对照组比较无明显差异(P>0.05);与对照组相比,AngⅡ组可诱导子宫内膜基质细胞数目明显增加(P <0.05);而与AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang-(1-7)(10-5mol/L)组的子宫内膜基质细胞数目明显减少(P<0.05)。8Ang-(1-7)和AngⅡ对的子宫内膜基质细胞活性的影响细胞培养72h后,免疫细胞化学染色法结果显示:对照组细胞有少量α-SMA阳性表达,几乎无TGF-β1和IGF-I阳性表达;Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组细胞α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显增加;与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显减少(P<0.05)。细胞培养72h后,ELISA检测结果显示:与对照组比较,Ang-(1-7)组细胞上清液中TGF-β1、IGF-I、ColⅠ和FN的含量无明显改变,与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞上清液中TGF-β1、IGF-I、ColⅠ和FN含量明显减少(P<0.05)。细胞培养72h后,western blot检测结果显示:对照组细胞有少量α-SMA阳性表达,几乎无TGF-β1和IGF-I阳性表达;Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组细胞α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显增加;与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显减少(P<0.05),与免疫细胞化学染色法结果一致。细胞培养72h后,Real time PCR检测结果显示:对照组细胞有少量α-SMAmRNA阳性表达,几乎无ColⅠmRNA、FN mRNA、TGF-β1mRNA和IGF-I mRNA的阳性表达; Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组细胞ColⅠmRNA、FN mRNA、α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA和IGF-ImRNA表达明显增加;与AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang-(1-7)组细胞ColⅠmRNA、FN mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1mRNA和IGF-I mRNA表达明显减少(P<0.05),与免疫细胞化学染色法和western blot检测结果一致。9Ang-(1-7)和AngⅡ对的子宫内膜活性的影响子宫内膜组织培养72h后,western blot检测结果显示:对照组有少量α-SMA阳性表达,几乎无TGF-β1和IGF-I阳性表达;Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显增加;与AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang-(1-7)组α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显减少(P<0.05)。子宫内膜组织培养72h后,Real time PCR检测结果显示:对照组组织中有少量α-SMA mRNA阳性表达,几乎无TGF-β1mRNA和IGF-ImRNA阳性表达;Ang-(1-7)组与之类似;与对照组相比,AngⅡ组α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA和IGF-I mRNA表达明显增加;与AngⅡ组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)组α-SMA mRNA、TGF-β1mRNA和IGF-I mRNA表达明显减少(P<0.05),与western blot检测结果一致。结论:1成功地分离、培养及鉴定子宫内膜上皮细胞及基质细胞。2成功地在体外构建子宫内膜三维立体结构的培养及鉴定。3在体外AngⅡ呈时间和剂量依赖地促进子宫内膜上皮细胞增殖。4AngⅡ可以促进子宫内膜上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化,表达肌成纤维细胞特异性蛋白α-SMA,而E-cadherin表达水平明显下降;并改变其分泌功能,使ColⅠ和FN合成增加。5Ang-(1-7)能抑制AngⅡ诱导的子宫内膜上皮细胞增殖。Ang-(1-7)能抑制AngⅡ诱导的子宫内膜上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化,抑制肌成纤维细胞特异性蛋白α-SMA的表达,而E-cadherin表达水平明显增加;并改变其分泌功能,使ColⅠ和FN合成减少。6在体外AngⅡ呈时间和剂量依赖地促进子宫内膜基质细胞增殖。7AngⅡ可以促进子宫内膜基质细胞活化,表达肌成纤维细胞特异性蛋白α-SMA,并改变其分泌功能,使ColⅠ、FN、TGF-β1和IGF-I合成增加。8Ang-(1-7)能抑制AngⅡ诱导的子宫内膜基质细胞增殖;Ang-(1-7)能抑制AngⅡ诱导的子宫内膜基质细胞活化,抑制肌成纤维细胞特异性蛋白α-SMA表达,并改变其分泌功能,使ColⅠ、FN、TGF-β1和IGF-I合成减少。9Ang-(1-7)可以抑制AngⅡ诱导的子宫内膜组织中α-SMA、TGF-β1和IGF-I表达明显增加,从而抑制子宫内膜纤维化。

全文目录


中文摘要  5-13
英文摘要  13-23
英文缩写  23-25
引言  25-28
第一部分 人子宫内膜的体外构建与鉴定  28-53
  前言  28-30
  材料与方法  30-39
  结果  39-42
  附图  42-48
  附表  48-49
  讨论  49-50
  小结  50-51
  参考文献  51-53
第二部分 Ang-(1-7)AngⅡ对人子宫内膜上皮细胞的影响  53-80
  前言  53-54
  材料与方法  54-66
  结果  66-69
  附图  69-74
  附表  74-76
  讨论  76-78
  小结  78
  参考文献  78-80
第三部分 Ang-(1-7)和AngⅡ对人子宫内膜基质细胞的影响  80-110
  前言  80-81
  材料与方法  81-93
  结果  93-96
  附图  96-104
  附表  104-106
  讨论  106-108
  小结  108
  参考文献  108-110
第四部分 Ang-(1-7)和 AngⅡ对人子宫内膜组织的影响  110-124
  前言  110-111
  材料与方法  111-116
  结果  116-118
  附图  118-120
  附表  120-121
  讨论  121-122
  小结  122-123
  参考文献  123-124
结论  124-125
综述 子宫内膜三维结构模型的体外构建及其应用的研究进展  125-135
  参考文献  133-135
致谢  135-136
个人简历  136

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 妇科学 > 女性生殖器损伤
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