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维生素K4对人前列腺癌PC-3细胞凋亡作用的研究

作　者: 姜雨
导　师: 麻彤辉
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 维生素K4 PC-3细胞 抗癌 凋亡 S期阻滞
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


在欧美男性中，前列腺癌是仅次于肺癌的第二大致死病症。前列腺癌主要发生于年龄较大的男性，有三分之二的患者年龄在65岁以上，而40岁以下的男性则很少发病。据一份检验报告指出，2012年约有24000例新增前列腺癌病例，约28000人死于这种恶性肿瘤。尽管近来在早期前列腺癌的诊断和多模式治疗方法上取得了一些进展，但对于那些雄激素非依赖性及激素难治性的复发病例，目前还没有很有效的治疗方法。因前列腺癌复发造成的死亡率仍然非常高，因此，寻找能够提高前列腺癌患者总体存活率的治疗方法是十分紧急且必要的。维生素K4（VK4）是一种水溶性的甲萘醌化合物，为VK2的人工合成衍生物，最初被用作临床止血药物。近些年已经有研究表明VK与血管健康、骨代谢有着密切关系，VK作为γ-亚麻酸蛋白家族如凝血素、凝血因子VII、凝血因子IX和凝血因子X合成中的辅因子，在凝血系统中扮演了很重要的角色。由于骨骼中含有3种VK依赖性蛋白（骨钙素，羧基谷氨酸蛋白，蛋白S），并且它们可能参与骨代谢，因此这些蛋白的功能受损可能对骨骼有不良影响。有报道指出VK还有免疫作用，并且VK对肝癌、白血病、结肠癌、肺癌、口腔癌、乳腺癌以及膀胱癌都有体外抗癌作用。本研究的目的在于探讨VK4对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的生长抑制作用及其相关机制。本实验采用MTT法测定VK4对PC-3细胞增殖的抑制作用，使用流式细胞术测定细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞内活性氧（ROS）水平、细胞内线粒体膜电位（MMP）变化，Hoechst33258染色观察细胞内核固缩与染色质片段化，台盼蓝染色观察VK4对正常小鼠脾细胞毒性作用，利用Western blot测定凋亡相关蛋白的表达。MTT结果显示，VK4对PC-3细胞增殖有抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖，IC50值约为20.94μM。Hoechst33258染色结果显示VK4引起了PC-3细胞内DNA的断裂产生凋亡小体。Annexin V-FITC/PI双染确定了VK4诱导了PC-3细胞凋亡。PI染色确定了VK4对PC-3细胞周期的阻滞发生在S期。进一步的机制研究发现VK4对PC-3细胞诱导凋亡的作用表现在降低了细胞内线粒体膜电位，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的下调，Bax的上调，促进了线粒体中细胞色素C（Cyt-c）释放，以及caspase-3和PARP的激活。本实验首次发现了VK家族新的药理活性，有理由认为VK4有希望作为治疗前列腺癌的有效药物。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-27
  1.1 前列腺癌概述  9-17
    1.1.1 前列腺癌的诊断  9
    1.1.2 引发前列腺癌发生的风险因素  9-12
    1.1.3 前列腺癌的常规治疗  12-16
    1.1.4 前列腺癌 PC-3 细胞株的研究进展  16-17
  1.2 维生素 K（VK）概述  17-26
    1.2.1 VK 的主要食物来源  18-19
    1.2.2 VK 含量的检测  19-20
    1.2.3 VK 的生物学作用  20-26
  1.3 本研究的目的及其意义  26-27
2 VK4 诱导人前列腺癌 PC-3 细胞凋亡  27-42
  2.1 实验材料  27
    2.1.1 实验仪器  27
    2.1.2 实验试剂  27
  2.2 实验方法  27-31
    2.2.1 细胞培养  27
    2.2.2 VK4 对 PC-3 细胞增殖的影响  27-28
    2.2.3 台盼蓝染色测定小鼠脾细胞毒性  28
    2.2.4 细胞周期分析  28-29
    2.2.5 Hoechst 33258 荧光染色法测定核固缩和染色质片段化  29
    2.2.6 流式测定细胞凋亡  29
    2.2.7 细胞内活性氧水平检测  29-30
    2.2.8 细胞内线粒体膜电位（ΔΨm）变化  30
    2.2.9 Western Blot 分析  30-31
  2.3 结果与分析  31-39
    2.3.1 VK4 对人前列腺癌 PC-3 细胞增殖的影响  31-32
    2.3.2 VK4 对人前列腺癌 PC-3 细胞形态学变化的影响  32
    2.3.3 VK4 对小鼠脾细胞的毒性作用  32-33
    2.3.4 VK4 对 PC-3 细胞有丝分裂的影响  33-34
    2.3.5 Hoechst 33258 荧光染色法观察核固缩和染色质片断化  34-35
    2.3.6 VK4 诱导 PC-3 细胞凋亡  35-36
    2.3.7 VK4 对 PC-3 细胞内活性氧产生情况的影响  36-37
    2.3.8 VK4 引起了 PC-3 细胞内线粒体膜电位的下降  37-38
    2.3.9 VK4 对主要的线粒体凋亡调控蛋白的作用  38-39
  2.4 讨论  39-42
3 结论  42-43
4 主要创新点  43-44
参考文献  44-57
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  57-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 男性生殖器肿瘤 > 前列腺肿瘤
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